臓器間ネットワークからみた脳梗塞病態におけるCRTCシグナルの意義について

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15695
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 神吉 秀明 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (10774218)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: CRTC

Outline of Annual Research Achievements

脳梗塞においては、Neurovascular Unitにおける様々なシグナルが脳内において活性化され、その中で我々はCREB-CRTCシグナルの重要性をこれまでに発見してきた。また、近年脳梗塞において重要な役割を果たすことが知られるようになったmicroRNA(miRNA)にも着目し、CREB-CRTC familyがmiRNAのコントロールに重要な役割を果たすことが考えられたために、CRTC1ノックアウトマウスを用いて検討したところ、CRTC1がmiRNA132/212の発現の影響を与えて脳梗塞を細胞膜の裏打ち蛋白と関連して脳梗塞を増悪させることが分かった。そこで更なるCRTC familyの脳梗塞における臓器間ネットワークでの病態解明を目指すために、次に炎症の観点からマクロファージに着目を行った。マクロファージ特異的にCRTC2をまずはノックアウトすべくCRTC2 flox/flox×LysMyc-CREマウスを作成し、その表現型を調べてみたが、あまり表現型に差を認めなかった。このために、次なる手段としてCRTC1/CRTC2 double flox/flox×LysMyc-CREマウスを作成し、現在その表現型を含めて検討を進めており、脳梗塞における影響を精査しているところである。また脳梗塞時での内皮細胞におけるCRTC2の役割は既に報告しているが、同時にCRTC1も内皮細胞に発現しており、CRTC1がその代役を果たすと考えられ、CRTC1/CRTC2のいわゆるdoubleの内皮細胞特異的ノックアウトマウスを作成して、現在脳梗塞における影響を検討中である。更にCRTC1、CRTC2、CRTC3のマクロファージや内皮細胞特異的なトリプルノックアウトマウスを作成しており、高脂肪食の負荷を加えており、その影響についても検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要欄にも記載したが、マクロファージ特異的にCRTC2をノックアウトすべくCRTC2 flox/flox×LysMyc-CREマウスを作成してその表現型を調べてみたが、あまり表現型に差が出なかった。このために、次の手段としてCRTC1/CRTC2 double flox/flox×LysMyc-CREマウスを作成し、現在その表現型を含めて検討を進めているところである。同時にダブルノックアウトマウスCRTC1/CRTC2 double flox/flox×Tie2-CRE2マウスを作成しており、現在内皮細胞の観点から脳梗塞における影響を調査中である。さらに、CRTC1、CRTC2、CRTC3のすべてをノックアウトすべくROSA26-ACREB-Knock In を作製し、Tie2-CRE及び、LysMyc-CREマウスと交配し、血管内皮特異的、及び、マクロファージ特異的にA-CREBを発現させ、CRTC familyのすべて、即ちCRTC1,2,3の全てをノックダウンしたマウスを作製、現在、高脂肪食を負荷して、その影響を精査中であり、概ね当初の計画した通りの進捗状況と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

CRTC familyの脳梗塞における臓器間のネットワーク病態の解明を目指しているところであり、まずは炎症の観点からマクロファージに着目した。そこで、CRTC1/CRTC2 double flox/flox×LysMyc-CREマウスを作成しており、現在その表現型を含めてFACSやqPCR、初代マクロファージ細胞の培養等を行いその影響を検討しているところである。また、内皮細胞の観点からの検討も重要であり、CRTC1/CRTC2 double flox/flox×Tie2-CRE2マウスを作成しており、現在脳梗塞における影響をこちらも実験的脳梗塞モデルの作成や初代内皮細胞の培養を行いその機能を調査中である。更により詳細にCRTC familyの動態を解明する目的で新規にCRTC1、CRTC2、CRTC3のすべてをノックアウトすべくROSA26-ACREB-Knock Inを作製し、Tie2-CRE及び、LysMyc-CREマウスと交配し、CRTC1,2,3の全てをノックダウンしたマウスを作製、現在、高脂肪食を負荷して、高脂肪食が内皮細胞やマクロファージにおいて脂肪細胞の増加や炎症が増加することによる影響とあわせて精査を行っていく予定である。

Causes of Carryover

予定していた実験に使用する物品の購入が実験の都合により延期したために次年度使用額が生じた。次年度早めに実験で物品購入に使用する予定である。