オンチップ血管網を用いたSturge-Weber症候群モデル構築と発症機序の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15909
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 坂野 公彦 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (40865630)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 血管内皮細胞 / iPS細胞 / スタージ・ウェーバー症候群 / １細胞解析 / 灌流

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、ゲノム編集技術を用いて作製したスタージ・ウェーバー症候群モデルiPS細胞を用いて、①オンチップ血管網作製技術、および灌流システムを構築することで、詳細なスタージ・ウェーバー症候群モデルを樹立し、②本症候群における血管奇形発症の病態に関与する遺伝子・遺伝子経路の探索を行うとともに、③正常、および様々な疾患の血管網に対して、灌流刺激がもたらす生理機構や、病態形成機構を解明することを目指している。
2021年度は、我々がこれまでに作製したスタージ・ウェーバー症候群モデルiPS細胞、および正常コントロールiPS細胞から、血管内皮細胞への効率的な分化誘導法の確立を行った。誘導した血管内皮細胞を用いて、微小デバイス上にて、播種する細胞数、培地に加えるサイトカイン濃度・期間などの条件検討を行い、血管網形成を行う培養系を確立した。微小デバイス自体の形状（チャネル数、幅など）に関しては、数種類について検討を行い、本実験系に最も適した形状のデバイスに変更できた。灌流に関して、マイクロポンプの流量、時間等の検討を行い、オンチップ灌流実験系を確立した。これらの技術によって得られた血管網構成細胞について、細胞の生存率を大きく低下させないような細胞剥離方法の検討を行った。最終的に選定した方法を用いて剥離した細胞サンプルを、シングルセルRNA解析（Chromium, 10x Genetics）に提出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、まず、スタージ・ウェーバー症候群モデルiPS細胞および正常コントロールiPS細胞の両者を血管内皮細胞に分化誘導した。微小チップ上で、灌流可能な血管網が作製できる培養方法を確立し、マイクロポンプを用いた血管網の灌流を行うことができた。血管網に対して酵素処理し得られた細胞を用いて、本年度の当初の目的であった、シングルセルRNA解析を提出することができた。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、スタージ・ウェーバー症候群モデルiPS細胞および正常コントロールiPS細胞由来血管網の灌流刺激の有無による違いを、シングルセルRNA解析のデータ解析を行うことで明らかにする。また、必要に応じて、重要な発現変化が認められる遺伝子・経路について、蛍光レポーター発現細胞の系を樹立することで、画像評価も行いたい。