アンジェルマン症候群 のUBE3Aアンチセンス転写抑制による新規遺伝子治療の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K15913
• Research Institution: National Center for Child Health and Development
• Principal Investigator: 三浦 茜 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 成育遺伝研究部, (非)研究員 (40795449)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2027-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / アンジェルマン症候群 / UBE3A-ATS転写抑制 / CRISPR/dCas9

Outline of Annual Research Achievements

アンジェルマン症候群はUbe3a遺伝子の欠失や変異による機能障害から引き起こされる。本研究では、dCas9-KREB-MeCPsによるUBE3A-ATS領域の転写調節技術によって、SNRPN領域のプロモーターで始まる伸長反応を抑制することで、Ube3a遺伝子発現回復を試みる。
本年は、CRISPR/dCas9を用いたUBE3A-ATS転写抑制の効率を検討するために必要な、dCas9-KRAB-MeCP2搭載発現ベクターと複数の標的領域に対するgRNAの作製を行なった。CRISPR/dCas9によるエピゲノム編集で、最もUBE3A-ATS抑制効率が高いgRNA配列を決定するために、8種類のgRNAを設計した。gRNAの標的領域として、プロモーター領域を含むsnrpn遺伝子と、UBE3A-ATSとSNRPN領域の中間に位置する遺伝子のipw遺伝子とsnord115遺伝子を選択し、U6プロモーター含むgRNA発現ベクターを作製した。
最適なgRNAを選択するために、ヒト神経芽細胞種のSH-SY5Y細胞株を使用した。SH-SY5Y細胞株からmRNAを抽出し、gRNAの標的領域を含む6種類の遺伝子領域 (snrpn遺伝子, ipw遺伝子, snord115遺伝子, snord116遺伝子, Ube3a遺伝子)と UBE3A-ATSの発現をRT-qPCR解析を用いて確認した。
今後は、SH-SY5Y株にdCas9-KRAB-MeCP2ベクターとgRNA発現ベクターをエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、UBE3A-ATS発現低下レベルにより、遺伝子治療に最適なgRNAを選択する。さらに、dCas9-KRAB-MeCP2ベクターと最適なgRNAベクターの配列を搭載した、AAV5ウイルスベクターの作製を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度の目標であった、UBE3A-ATS転写抑制に必要なCas9ベクターと複数のgRNAベクターの作製、およびヒト神経芽細胞腫での標的遺伝子とUBE3A-ATSの発現を確認できた。しかし、最適なgRNA選択のために、神経芽細胞腫へのCas9ベクターと複数のgRNAベクターの遺伝子導入による、UBE3A-ATS発現低下の解析は途中である。

Strategy for Future Research Activity

神経芽細胞腫を用いて、UBE3A-ATS転写抑制に最適なgRNA配列を確認した後、Cas9配列と選択したgRNA配列を含むウイルスベクターを作製する。作製したウイルスベクターをHEK293T細胞へ遺伝子導入を行い、ウイルス産生細胞を作製する。ウイルス産生細胞から、AAV Extraction solutionを使用して、ウイルス粒子の精製を行う。作製したウイルス粒子は神経芽細胞腫に感染させ、UBE3A-ATS発現低下の確認を行う。

Causes of Carryover

研究計画がやや遅れ、予定していたウイルスベクターおよびウイルス粒子の作製を次年度に行うことになった。そのため、ウイルス粒子作製に必要な物品は、使用期限の関係から次年度に購入予定となったため。