2021 Fiscal Year Research-status Report
糸球体上皮細胞特異的転写因子MAFB変異による巣状糸球体硬化症発症メカニズム解析
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21K16157
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
臼井 俊明 筑波大学, 医学医療系, 講師 (50825099)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | MAFB / 巣状糸球体硬化症 / 糸球体上皮細胞 / 転写因子 / 疾患モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
MAFBは、腎臓の糸球体上皮細胞特異的転写因子である。これまでヒトのMAFB変異による疾患として、多中心性手根足根骨融解症候群(MCTO)とデュアン眼球後退症候群(Duane症候群)が知られている。MAFB変異をもつこの2疾患は腎の糸球体上皮細胞障害をきたし、慢性腎臓病の一種である巣状糸球体硬化症をきたす。腎の病型は同じだが、2疾患のMAFB変異部位は異なっており、ヒト腎生検でのMAFB染色パターンに加えて腎以外の表現型も大きく異なる。本研究では、ゲノム編集技術を用いて2疾患と同じ変異を持つ疾患モデルマウスを解析して、2疾患のMAFB変異がいかに巣状糸球体硬化症をきたすかを明らかにすることを明らかにすることを目的とした。
ゲノム編集(CRISPR-Cas9システム)を用いて、ヒトMCTO患者と同じ変異 (p.Pro59LeuMAFB変異) をもつ疾患モデルマウス(MCTOマウス)、ヒトDuane症候群患者と同じ変異(p.Leu239ProMAFB 変異)をもつマウス(Duaneマウス)を筑波大学生命科学動物資源センターで作製した。
MCTOマウスは、若齢期からアルブミン尿を呈して腎に巣状糸球体硬化症を呈すること、Duaneマウスもポドサイト障害を起こすことを確認し、ヒト疾患と同様のタンパク尿や糸球体上皮細胞障害の表現型を示すことを確認した。MCTOマウスの腎臓の単離糸球体のRNA-seqを行い、現在、分子メカニズムの解析中である。
研究の途中経過報告が、高く評価され、第64回日本腎臓学会学術総会で一般優秀演題賞を受賞した。また、研究内容を含む総説が査読付き国際学術雑誌でAcceptされた。研究内容について査読付き国際学術雑誌への投稿準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集(CRISPR-Cas9システム)を用いて、ヒトMCTO患者と同じ変異 をもつ疾患モデルマウス(MCTOマウス)、ヒトDuane症候群患者と同じ変異(p.Leu239ProMAFB 変異)をもつマウス(Duaneマウス)を筑波大学生命科学動物資源センターで作製した。
MCTOマウスは、若齢期からアルブミン尿を呈して腎に巣状糸球体硬化症を呈すること、Duaneマウスもポドサイト障害を起こすことを確認し、ヒト疾患と同様のタンパク尿や糸球体上皮細胞障害の表現型を示すことを確認した。
MCTOマウスの腎臓の単離糸球体のRNA-seqを行い、現在、分子メカニズムの解析中である。
研究の途中経過報告が、高く評価され、第67回日本腎臓学会学術集会総会で一般優秀演題賞を受賞し、査読つき国際学術雑誌への投稿準備まで進められており、順調に進展しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
MCTOマウスの単離糸球体のRNA-seqの結果で、RNAレベルで変化のある糸球体上皮細胞関連遺伝子を同定して、得られた結果をもとにpathway解析を行って糸球体上皮細胞障害メカニズムを明らかにする。また、RNA-seqで変化が有意であった遺伝子については、腎病理標本を用いた免疫染色や、凍結サンプルを用いたウエスタンブロットも行いタンパクレベルでの追加解析も行う。
MCTO、Duane 症候群と同じ変異を持ったMAFBによるレポーターアッセイ：糸球体上皮細胞特異的蛋白であるNephrinのプロモーターを用いたルシフェラーゼアッセイを行う。MAFBがNephrinの転写制御に極めて重要なことは研究代表者らが報告している 。MCTO変異MAFB、Duane変異MAFB、野生型MAFBを293T細胞に発現させ、ルシフェラーゼの発光を測定する。転写活性がそれぞれの変異でどのように変化するかどうかを観察する予定である。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響で、研究用の抗体などの消耗品の生産のおくれと品不足があったこと、さらにコンテナ便が混んでいるため、輸入に時間がかかり研究用年度跨ぎになったこと、予定していた疾患モデルマウスの腎臓の単離糸球体のRNA-seq解析支払いの解析費用が、解析用試薬の輸入が、コロナ禍での輸入に時間がかかり研究用年度跨ぎになったことが主な理由である。
次年度で残額分の研究費を使用して、予定の研究用抗体購入や、RNA-seq解析を含めた実験動物の解析費用に充てる計画とする。
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