慢性腎臓病の分子病態解明に向けた腎エリスロポエチン産生細胞由来細胞株の解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16170
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 佐藤 浩司 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (60888650)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 慢性腎臓病 / 腎線維化 / 腎性貧血 / エリスロポエチン / 低酸素誘導因子 / DNAメチル化 / TGFβ

Outline of Annual Research Achievements

腎エリスロポエチン産生細胞（REP細胞）由来の細胞株であるReplic細胞は、障害腎においてREP細胞が形質転換した筋線維芽細胞の形質を有しており、エリスロポエチン（EPO）産生能を喪失している。Replic細胞のEPO産生能喪失の原因として細胞自律的なTGFβシグナルの活性化およびEPOと低酸素誘導因子HIF2αの遺伝子領域のDNAメチル化による遺伝子発現抑制が明らかになっている。
DNAメチル化に対し、Replic細胞で遺伝子発現が亢進していたDNAメチル化酵素であるDNA methyltransferase 1 (Dnmt1)の阻害薬である5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza)をReplic細胞に投与したところ、EPO遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化が軽減した。さらにTGFβ阻害薬であるSB431542をReplic細胞に投与したところ、筋線維芽細胞マーカーの発現が有意に低下することが明らかになった。一方、ウイルスベクターを用いたHIF2αの恒常的過剰発現を同細胞に試みたが、細胞へのウイルス感染は確認できず、プラスミドを用いたHIF2αの一過性過剰発現においても、現在のところHIF2α恒常的過剰発現の細胞は得られていない。以上から、5-AzaとSB431542を併用し、様々な薬物濃度と曝露期間におけるHIF-PH阻害薬の投与によるEPO遺伝子発現を評価したが、現時点ではEPO産生誘導は認められていない。以上から、Replic細胞の形質の可塑性は一部認められるものの限定的であり、現時点では不可逆的に形質転換したREP細胞のモデルであると考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Replic細胞はCKDにおいて高度に形質転換が進行したREP細胞のモデルであり、腎線維化の解析において有用である。一方で現時点ではEPO産生誘導は確認されていないことから、腎性貧血の治療ターゲットの同定に用いることは困難であるため。

Strategy for Future Research Activity

Replic細胞を用いた腎線維化の新規バイオマーカーの探索を目的とする。先行研究で、腎障害におけるREP細胞の筋線維芽細胞への形質転換は段階的であることが明らかになっている。また、臓器線維化マーカーは多数知られているが、腎線維化の重症度との関連については十分に検討されていない。Replic細胞は高度に形質転換したREP細胞のモデルであるため、生体腎から単離した種々の形質転換段階の筋線維芽細胞や、血管内皮細胞などの他種類の細胞と、線維化マーカーの発現を比較検討することにより、腎線維化の重症度の評価に有用なマーカーの同定を目指す。

Causes of Carryover

RT-PCRとウエスタンブロットによる線維化マーカーの解析を次年度に行う見込みであり、試薬購入を予定している。さらに、現時点でReplic細胞に対するHIF2α過剰発現系は確立できておらず、ウイルスベクターやプラスミドの導入実験の一部を次年度も継続して行う予定であるため。