Functional analysis of novel BMP antagonist as causal factor of kidney disease progression in diabetes

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16173
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 小林 洋輝 日本大学, 医学部, 専修医 (70802156)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: NBL１ / BMP-7 / EMT / 糖尿病性腎症

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者はBone Morphogenetic Protein（BMP)- ７のantagonistであるNeuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1（NBL１）が将来の末期腎不全(ESRD)を強力に予測するバイオマーカーであることを明らかにした。またNBL１KOマウスが、UUOにより誘導した腎線維化に対して抵抗性があることがわかったが、腎線維化に関与する分子機序や、糖尿病性腎症でのNBL１の役割は未知であるため、これらを明らかとすることを目的とした。
①ヒト近位尿細管細胞であるHK-２細胞を、７０％コンフルエントまで培養し、DMEM無血清培地(コントロール : 低グルコース５.６mM)でserum starvaitonを２４時間行った後、高グルコース(３３mM )で２４時間刺激したところ、コントロールに比べて高グルコース刺激の細胞では、NBL1のmRNAは有意に上昇した。また同様に、HK-２細胞をrecombinant human TGFβ1 (５ng/ml)で２４時間刺激したところ、コントロールに比べてNBL1 mRNAの発現が上昇した。これらの結果を元に、HK-2細胞をrecombinant NBL1(１２５ng/ml)あるいはTGFβ1(５ng/ml)で７２時間培養した。刺激後４８時間から７２時間までに、共にαSMA、fibronectin、vimentin等EMTマーカーのmRNAの発現が上昇した。
②NBL１ KOマウス(ホモタイプ、ワイルドタイプ)を麻酔下で右腎摘出を行った後に高脂肪餌を与え、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病マウスを作成した。糖尿病発症確認後２４週まで4週間毎に体重、血糖値の測定、採尿を現在行っている。
飼育後は、麻酔下で安楽死させ血清、臓器を採取し、NBL１の発現等解析する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト尿細管細胞であるHK-２細胞を用いた培養実験では、高血糖やTGFβ1による細胞への刺激がNBL1の発現に上昇させることがわかった。このHK-2細胞をrecombinant NBL１で刺激すると、TGFβ1、αSMA、vimentin、fibronectinの発現が上昇し、一般的にEMTを誘導すると知られているTGFβ１で細胞を刺激した際の変化に近いことがわかった。また動物実験は、 KOマウスの繁殖も順調に進んでおり、現在、片腎摘後に高脂肪餌を負荷し、STZを投与して実験を行っているところであり、本研究課題の進捗状況は概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後、培養実験においては、HK-２細胞に対して、NBL１のsiRNAを導入し、mRNAの発現抑制下において、刺激因子である高血糖、およびTGFβ１での培養を行い、刺激因子に対するEMTマーカー（αSMA、Eーcadherin、vimentin)やCOL4A、SMAD１／５、SMAD2／3のリン酸化への影響を検討する。NBL１ KOマウス(ホモタイプ、ワイルドタイプ)の糖尿病モデルマウスを使用した動物実験においては、飼育終了後に得られた血液および腎臓について、NBL１の発現をELISA等で検討する。また組織は、HE染色やMasson染色等を行う。さらにNBL１KOマウスのホモタイプとワイルドタイプにおいて、EMT、ポドサイト障害の評価を免疫組織学的に行う予定である。