Functional analysis of novel BMP antagonist as causal factor of kidney disease progression in diabetes

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16173
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 小林 洋輝 日本大学, 医学部, 助教 (70802156)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: NBL1 / BMP-7 / EMT / 糖尿病性腎症

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者はBone Morphogenetic Protein(BMP)-7のantagonistであるNeuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1(NBL1)が将来の末期腎不全(ESRD) を強力に予測するバイオマーカーであることを明らかにした。またNBL1KOマウスが、UUOにより誘導した腎線維化に対して抵抗性があることがわかったが、腎線維化に関与する分子機序や、糖尿病性腎症でのNBL1の役割は未知であるため、これらを明らかとすることを目的とした。
1) ヒト近位尿細管細胞であるHK-2細胞に、NBL1のsiRNAをトランスフェクションし、DMEM無血清培地でserum starvaitonを24時間行った後、TGFβ1 (5ng/ml)を培地に添加し４８時間刺激した。これらの細胞から蛋白を回収し、western blotを行った結果、negative control siRNAでは、TGFβ1の刺激によって、EMTのマーカーであるE-cadherinの発現がDMEM培地と比べて減少したが、NBL1 siRNAをトランスフェクションした細胞では、E-cadherinの減少が抑制された。またαSMAの発現は、negative control siRNAでは、その発現が上昇したが、NBL1 siRNAでは、コントロールsiRNAと比べると発現が低下していた。現在は、SMAD1/5、SMAD2/3のリン酸化への影響を検討中である。
2) NBL1 KOマウス(ホモタイプ、ワイルドタイプ)を、麻酔下で右腎摘出を行った後に高脂肪餌を与え、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病マウスを作成した。糖尿病発症確認後24週まで飼育後に麻酔下で心臓より全採血を行い、臓器を採取した。現在、組織でのmRNA、タンパクの発現解析や、組織染色を行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト尿細管細胞であるHK-2細胞を用いた培養実験では、NBL1をノックダウンさせることにより、TGFβ１の刺激によるEMTの誘導が抑制されることがわかった。また動物実験においては、NBL1 KOマウスは、片腎摘後に高脂肪餌を負荷し、STZを投与して糖尿病を発症させた。このマウスを24週間飼育後、組織を摘出し、現在解析を行っており、本研究課題の進捗状況は概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後、培養実験では、今年度行ったNBL1 siRNAを導入した実験において、刺激因子を高血糖（33mMグルコース）にし、EMTマーカー(αSMA、Eーcadherin、vimentin)やCOL4A、SMAD1/5、SMAD2/3のリン酸化への影響を検討する。NBL1 KOマウス(ホモタイプ、 ワイルドタイプ)の糖尿病モデルマウスを使用した動物実験では、得られた組織について、さらに解析を進め、腎臓に対するNBL1の役割を検討する。