2021 Fiscal Year Research-status Report
脂肪細胞が分泌するアディポカインを軸とした全身性強皮症の病態解析
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21K16284
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宮川 卓也 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60843323)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 全身性強皮症 / 脂肪細胞 / アディポカイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全身性強皮症の病態に関与が示唆されるも詳細が分かっていないアディポカインの病態解析を行うため、全身性強皮症様の線維化と血管障害を自然発症する脂肪細胞特異的Fli1欠損マウス（Fli1 AdipoKOマウス）の脂肪細胞を単離して、アディポカインの発現パターンをコントロールマウスと比較することとした。まず12週齢のFli1 AdipoKOマウスならびにコントロールマウスの脂肪組織を摘出した。マウス皮下脂肪を摘出後ミンスし、コラゲナーゼ処理後、ろ過、遠心を行い、脂肪細胞を回収した。得られた脂肪細胞に関してフローサイトメトリーを用いて純度を確認したところ、十分な純度が得られていなかった。次に精巣周囲脂肪に関して同様に実験を行った。精巣周囲脂肪に関しては、皮下脂肪よりも純度が高かったが、検討に足る純度の脂肪細胞は得られなかった。その後、精巣周囲脂肪に関してコラゲナーゼ処理の時間や遠心する時間など細かく条件をかえ、一番よい純度の脂肪細胞に関してシーケンサーを用いて網羅的に解析した。これまでに全身性強皮症と関連があると言われていたアディポネクチン、ビスファチン、レジスチン、リポカリン２、オメンチンなどのアディポカインに関してはFli1 AdipoKOマウスとコントロールマウスに関して有意差は見られなかった。今後、得られた脂肪細胞の純度をさらに高めて再検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脂肪細胞単離のプロトコルは以前より存在するが、実際にやってみると思ったような純度が得られず、また脂肪細胞の量に関しても、シーケンサーを使った網羅的な解析を行うためにはマウス4－5匹分の皮下脂肪や精巣周囲脂肪が必要であった。純度を高めるためにプロトコルの条件設定を少しずつ変更して何度も試行錯誤したこと、また十分なマウスの数を得るのに時間がかかった点などを合わせて、予定より遅れることとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた脂肪細胞の純度をさらに高めてRNAシーケンスで再検討する予定である。また並行して別の方法でFli1 AdipoKOマウスの脂肪細胞由来のアディポカインをタンパクレベルで検討する。Fli1 AdipoKOマウスでは骨髄由来の新生血管に異常が見られ、骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSCs）は未熟な周皮細胞で見られるフェノタイプを示すことが分かっている。また脂肪細胞とBM-MSCsの共培養にてFli1 AdipoKOマウスの脂肪細胞がWild typeマウスのBM-MSCsのフェノタイプを変化させることが確認されている。純度を上げたFli1 AdipoKOマウスの脂肪細胞とWild typeマウスのBM-MSCsの共培養を行った上清中のアディポネクチンのタンパクをコントロールマウスの脂肪細胞とWild typeマウスのBM-MSCsの共培養の上清中のタンパクと比較することで、タンパクレベルでの差を確認することができる。
検討後変化が見られたアディポカインに関しては以下の検討を行う。Fli1 AdipoKOマウスでは、皮下脂肪組織が形質転換を起こし筋線維芽細胞になることで線維化を、骨髄内脂肪細胞がBM-MSCsに作用し未熟な周皮細胞を形成することで血管障害を起こしていることが示唆されている。脂肪細胞が分泌するアディポカインに関して、上昇している因子に関しては、in vitroでアディポカインのsiRNAをBM-MSCｓに添加しBM-MSCsのフェノタイプの変化を確認するとともに、培養脂肪細胞にも添加し筋線維芽細胞への形質転換の有無を確認する。さらにin vivoにて、存在するものでは中和抗体を投与し、病態への寄与をさらに細かく検討を行う。低下している因子に関しては、in vitroおよびin vivoでリコンビナントタンパクを投与し、同様に病態への寄与を検討する。
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