The effect of YAP/TAZ on impaired vasculature and immune abnormalities in scleroderma

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16290
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 遠山 哲夫 東京大学, 医学部附属病院, 届出研究員 (30757513)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: YAP / ROCK / endothelial cell / pericyte

Outline of Annual Research Achievements

本研究で、YAP/TAZからhippo pathwayの阻害作用のあるROCK阻害剤であるファスジルをブレオマイシン誘発強皮症モデルマウスに投与すると、Th1/Th2バランスがTh1にシフトし、またTh17/TregバランスがTregにシフトすることが in vitroで確認できた。これがファスジルの直接作用であるのか確認するために、野生型C57/B6マウスの脾臓から採取したナイーブT細胞をTh1、Th2、Th17細胞に分化させる実験を行ったところ、ファスジルの投与でTh1,Th2への分化に対しては影響なかったが、Th17への分化を明らかに抑制することが明らかになった。
全身性強皮症における血管障害は、転写因子Fli1の欠失により再現できるが、siRNAにより血管内皮細胞のFli1発現をノックダウンさせたところ、YAP/TAZの下流の転写因子TEADが結合するプロモーターアクティビティが上昇することをルシフェラーゼアッセイにより示され、Fli1がYAP/TAZと相互作用することが明らかになった。YAPのsiRNAを用いたノックダウンでFli1の発現は亢進し、逆にS127A YAP plasmidをtransfectionした血管内皮細胞ではFli1の発現が低下したことから、細胞外stiffnessがFli1の発現を制御しうることが示された。
また血管内皮細胞の脈管形成を調べるため、Tube formationを行ったところ、Fli1をノックダウンさせた場合、幼弱な脈管が多数形成されることが示されたが、YAP/TAZを阻害するファスジルを投与したところ、過剰な脈管形成が抑制された。血管内皮細胞とpericyteを共培養させたところ、ファスジルによりpericyteが被覆した脈管が長時間維持されることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

転勤に伴い実験室になかなかアクセスできなくなっているため。

Strategy for Future Research Activity

また、Fli1の欠失によるフェノタイプが、YAP/TAZ/TEAD pathwayの過剰亢進のみで説明できるのかをS127A YAP plasmidを血管内皮細胞およびpericyteにtransfectionすることにより確認する。Tube formation、transwell assay、scratch assay、BrdUの測定を介して、血管新生能、遊走能、増殖能といった細胞の恒常性を評価する。さらに、RNA-seq、western blottingを介して、遺伝子発現、細胞内シグナリングの変化を解析する。
Pericyteや皮膚リンパ管内皮細胞のフェノタイプがYAPの発現の有無でどのように変化するのかを、siRNAとS127A YAP plasmidのtransfectionをすることで解析する。RNA-seqにより解析を行う予定である。PericyteのYAPの発現の変化が血管内皮細胞に与える影響を共培養下のtube formationにて確認する。
また予備実験により、YAP/TAZによりSmad2/3、Smad1/5の活性化が変化することが示されており、この機序について解析を進める。

Causes of Carryover

転勤に伴い新しい実験環境の構築、また論文執筆作業にエフォートが割かれてしまったことも要因となった。

次年度は、皮膚微小血管内皮細胞の購入、皮膚リンパ管内皮細胞の購入、T細胞単離・培養のためのキット、regulatory T cellのexpansion kitの購入などに充てる予定である。