2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of airway epithelial keratinization and barrier function as a novel therapeutic target for asthma
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21K16308
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
井上 英樹 昭和大学, 医学部, 兼任講師 (80813162)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 重症喘息 / 気道上皮 / 真菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真菌の気道上皮への曝露への影響を検討するため、気道上皮細胞の培養を用い、真菌抽出液を培地に加えその影響の検討を行った。
in vitroでの検討として気道上皮細胞として16HBE14o-, Calu-3の細胞株を用い、培地に浸した状態(submerged)での刺激実験を行った。アレルゲン曝露としてアルテルナリア抽出液の曝露を行い、気道上皮の状態や各種サイトカインの分泌の検討を行った。高濃度のアルテルナリア抽出液の曝露は細胞へのダメージが大きく、細胞死に至ったが、一定濃度以下のアルテルナリア濃度の曝露によっては細胞死には至らなかった。上皮角層蛋白の遺伝子発現を解析したところ、ある一定濃度のアルテルナリア抽出液の曝露によって上皮角層蛋白の１種であるケラチン6bの遺伝子発現の増加が認められた。
アルテルナリア抽出液曝露によるサイトカイン分泌を評価するため細胞上清中のサイトカインの測定を行った。IL-6, IL-8などの炎症性サイトカインの測定を行ったが、今回測定した条件下においては有意な変化は認められなかった。アルテルナリア抽出液の濃度および、ELISAの測定条件、細胞上清中の濃度の調整を行い、引き続き検討を行っている状況である。
より生体に近い条件での気道上皮細胞の評価を行うため、気相―液相培養(ALI培養)の検討を行った。気道上皮細胞株である16HBE14o-を用いsubmergedの条件下においては、細胞培養はコンフルエントの状況に至ったが、TranswellインサートによるALI培養では、コンフルエントの状況を維持することが難しく、細胞死に至る状況であった。今後、培養液の変更や培養期間の調整を行うことによって、実験に供しうるALI培養の状態を維持するための条件を引き続き検討を行っている状況である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
気道上皮細胞株である16HBE14o-, Calu-3の培養を行い、気道上皮バリアー機能の評価を行っている。submergedの条件下での培養状況は良好であるが、ALI培養での実験条件の調整を行っており進捗状況がやや遅れている。それに伴って、内因性上皮角層蛋白誘導体であるJTC-801などの気道上皮角層蛋白の修復因子の投与濃度などの実験条件の調整を次年度に行う予定である。
また、真菌抽出液であるアルテルナリア抽出液の曝露によって上皮角層蛋白の１種であるケラチン6bの遺伝子発現の増加が認められた。本研究の実験仮説では真菌曝露により上皮角層蛋白が障害を受け、上皮角層蛋白の減少が認められると考えていた。今回観察されたケラチン6bの遺伝子発現の増加が、上皮角層蛋白の障害による代償性の遺伝子発現の増加なのかどうか検証を行う必要がある状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
気道上皮細胞における角層蛋白発現と気道上皮バリアー機能、気道炎症の関与を検討し、気道上皮角層蛋白の補充が喘息病態を改善するか明らかにする。気道上皮細胞における上皮角層蛋白（フィラグリン、ケラチン6bなど）の発現と気道上皮バリアー機能、気道炎症の関連を、細胞・動物モデル・臨床検体それぞれの段階において検証を行う。気道上皮細胞で角層蛋白遺伝子のノックダウンを行い、上皮角層蛋白の喪失が気道上皮バリアー機能の低下を招き気道炎症を惹起することを明らかにする。喘息モデルマウスにおいて上皮角層蛋白補充治療が気道炎症の悪化を抑制することを示す。最終的には喘息患者の喀痰や鼻腔上皮細胞の上皮角層蛋白発現と喘息フェノタイプの関連を検討し臨床応用への可能性を探る。
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| Causes of Carryover |
研究計画の進捗状況の変化により本年度に行う実験を次年度以降に計画したため、次年度使用額が発生した。また、新型コロナウイルス感染症の影響により旅費の支出がなかったため、次年度使用の予定とした。
実験計画としては、in vitroで、気道上皮細胞の上皮角層蛋白発現と気道上皮バリアー機能、気道炎症の関連を明らかにする。気道上皮細胞株として、上皮接着因子が発現しているCalu-3、16HBE14o-及びヒト気道上皮細胞（NHBE）を用いる。細胞をTranswellインサートで培養し、液相下（submerged）もしくは、気相―液相下(ALI)培養で気道上皮細胞を分化させる。外部刺激として、ハウスダスト、真菌（アルテルナリア）抽出液を気相培地面に添加し、上皮角層蛋白の発現と細胞間接着因子（カドヘリン、ZO-1など）の発現、炎症性サイトカイン（IL-6、IL-8など）の分泌を測定する。上皮細胞間結合性の評価として、経上皮電気抵抗を測定する。気道上皮細胞修復能の評価として、scratch-woundアッセイを用いる。siRNAによる上皮角層蛋白遺伝子のノックダウンが、気道上皮バリアー機能や気道上皮細胞修復能に影響を与えるか調べる。
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