2021 Fiscal Year Research-status Report
A study of developing a rapid and comprehensive genetic testing method for the diagnosis and treatment of bloodstream infections
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21K16327
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
青木 弘太郎 東邦大学, 医学部, 助教 (50821914)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 血流感染症 / 全ゲノム解析 / ナノポア型シークエンサー / Flongle / MinION |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、東邦大学医学部倫理委員会の承認を受けて、診療上必要な検査として提出された血液培養検査の残余検体の6検体を対象にプレリミナリーに検討を開始した。その結果、ナノポア型next-generation sequencer (NGS) のMinION (Oxford Nanopore Technologies: ONT) を用いた事前検討により構築したプロトコールでは、ナノポア型next-generation sequencer (NGS) のFlongle (ONT) によって満足のいく出力が得られなかった。Flongleの品質が不安定であることが懸念されたが、Flongleの品質の影響を受けにくい頑健なプロトコールを構築するため、簡易DNA抽出工程に代えて自動機器を用いた高純度DNA抽出工程を採用したプロトコールへシフトした。改良版プロトコールの妥当性は、当研究室に保存された全ゲノム解析済みの薬剤耐性菌 3菌種3株を用いた、菌液スパイクにより作成した血液培養疑似検体により行った。その結果、Staphylococcus aureusおよびKlebsiella pneumoniaeでは良好な結果が得られ、予想外にもEscherichia coliでは出力データがほとんど得られなかった。菌種依存的な夾雑物のキャリーオーバーがライブラリ調整あるいはナノポアシークエンシングに悪影響を及ぼしている可能性が指摘されたため、DNA抽出に供する菌量およびライブラリ調整に供するDNA濃度を調整したところ、出力データ量が向上した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MinIONを用いた事前検討においてワークすることが確認できていたプロトコールをFlongleに適用したところ、実際の患者血液培養残余検体において満足のいくFlongleの出力が得られなかった。2021年時点において、Flongleはまだまだ品質が不安定な製品であることが明らかになった。品質の改善を待ちつつ、プロトコール上の改善を勘案した。具体的には、シークエンスにおいて不利な粗精製の簡易DNA抽出ステップを、自動機器による高純度DNA抽出プロトコールへ置き換えた。本プロトコールの妥当性を全ゲノム解析がされている保存菌株を用いたスパイク血液培養疑似検体によって確認した。この経験は、本プロトコールを検査に実装したときのトラブルシューティングの知見となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画段階で採用していた簡易DNA抽出工程を、自動機器による高純度DNA抽出工程へ置き換え、妥当性の検討を推し進める。当教室に保管されている全ゲノム解析済みの6菌種30株 (1菌種あたり5株) によって菌液スパイク血液培養疑似検体を作成し、改善版プロトコールによる解析を行う。これらのプロトコールおよびデータを論文化する。また、論文執筆と並行して患者血液培養残余検体による検討を再開する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症流行を受けて、PCR検査業務および関連研究がエフォートを圧迫した。そのため、計画通りに臨床検体を用いた検討が進まなかった。さらに、臨床検体を用いた検討により、ナノポア型NGSのFlongleの品質不安定性が結果に影響したことが懸念されたため、それを回避するためのプロトコール頑健性向上に関する検討ならびにその妥当性確認を行った。以上の理由から、次年度使用額が生じた。
次年度は、改善したプロトコールにて着実にデータを蓄積するために、菌液スパイク血液培養疑似検体を用いた検討を進め、論文化を進めつつ、患者サンプルを用いた本プロトコールの検証を進める。
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