Verification of therapeutic effects by amniotic fluid stem cell sheet for rat myelomeningocele model.

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16599
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 山崎 和義 北海道大学, 大学病院, 助教 (10883275)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 脊髄髄膜瘤 / 羊水幹細胞シート / 胎児期手術

Outline of Annual Research Achievements

ラット脊髄髄膜瘤モデルに対して、同種羊水幹細胞シート移植の治療効果の検証を目的として、羊水幹細胞シートの作成が可能かを実験で確認した。妊娠14日のSDラットを、安楽死後に開腹して子宮内の胎仔周囲の羊水を吸引・採取した。採取した羊水を遠心分離して、幹細胞を培養皿に播種して培養を継続し、複数回の継代が可能であることを確認した。継代後の幹細胞を、温度応答性の培養皿に播種し、アスコルビン酸入りの培養液で培養継続し、均一にコンフルエントになるまで培養することで、一定の確率であるが幹細胞シートが作成可能であることを確認した。
また、温度応答性の培養皿で培養した羊水幹細胞シートは、室温環境に移すことで培養皿から容易に剥離できることが確認できた。妊娠18日目のラットを安楽死後に、開腹して胎仔を摘出し、手術用顕微鏡を用いて胎仔の背中に幹細胞シートを破損することなく貼付し、10-0ナイロン糸で胎仔組織に縫合固定実験を行い、シートの移植が手技的に可能であることを確認した。加えて、妊娠ラットを全身麻酔下に小開腹し、子宮を小切開後に縫合する手術を行った結果、高確率で術後母体が生存可能であり、胎児手術を想定した実験が遂行できる可能性も確認した。
妊娠ラットの手術後、十分な管理が可能な準備が整った段階で、妊娠ラットにレチノイン酸を経口投与して胎児脊髄髄膜瘤モデルを誘導し、幹細胞シート移植の胎児実験に移行し、移植後の組織評価と、出産が可能な場合は出生後の運動機能評価なども検討し、治療効果を確認する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

培養した羊水幹細胞からシートが安定して作成することができず、条件の確認に時間が必要であった。また、胎児手術後の観察に要する時間と人手の確保が難しく、実験計画が予定通り進捗できず、初年度は実験手技の確認段階で終了した。

Strategy for Future Research Activity

既に確立されている、ラット胎児脊髄髄膜瘤モデルの作成が可能であることを早急に確認し、羊水幹細胞シート移植実験を順次行っていく予定である。
胎児手術後、一定期間母体が生存できることが確認できた段階で、胎仔の組織学的評価も開始し、治療効果について検証する。
手術後、出産も可能であれば、一定期間新生児の観察を継続し、成長した段階で組織学的評価目的に神経組織を採取し検証を行い、成果を発表する。

Causes of Carryover

コロナの影響で消耗品の入手が困難で研究が思うように進まなかった