Analysis of signal pathway control mechanism of Moyamoya disease susceptibility gene

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16607
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 崔 廷米 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, リサーチフェロー (40896180)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: RNF213 / もやもや病

Outline of Annual Research Achievements

RNF213は、もやもや病の感受性遺伝子として同定され、p.R4810K多型はもやもや病のみならず、脳梗塞・肺高血圧症など多様な血管狭窄病変の要因となることが示されている。しかし、RNF213による多様な血管狭窄病変に至る分子機構は未解明であり、その理由としてRNF213自身の制御機構が不明であることが挙げられる。応募者は、質量分析によりRNF213が結合する蛋白質がユビキチン化されることを発見し、ユビキチン化リジン残基候補も見出している。
そこで本研究では、RNF213結合蛋白質との機能的相互作用に着目し、双方向性制御システムを起点に分子レベルでの役割を包括的に解析することで、もやもや病発症の要因となるシグナル異常を同定することを目的としている。
本年度は、RNF213結合蛋白質とRNF213間の双方向性シグナル経路の解析を行った。RNF213が結合蛋白質ユビキチン化の役割を知るため、RNF213と結合蛋白質をHEK293細胞に過剰発現させ、K63やK48ポリユビキチン鎖などの特定リンケージを認識するTandem Ubiquitin Binding Entityを用いたプルダウン法を行った。その結果、RNF213が結合蛋白質に付けるポリユビキチン鎖の性状を特定した。
一方、RNF213結合蛋白質によるRNF213依存性シグナル経路制御の検討を行った。血管内皮細胞においてRNF213を発現誘導すると報告されている炎症惹起因子を添加し、RNF213とRNF213結合蛋白質の相互作用を検討した結果、RNF213の発現量を増加させる炎症惹起因子においては、RNF213結合蛋白質との結合量が変化し、下流シグナルにも影響を及ぼすことを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

血管内皮細胞におけるRNF213と新規結合蛋白質の双方向性シグナル経路解析において、多様な角度から検討を行い順調に結果が出ている。現在、論文化の作業も並行して進めている。

Strategy for Future Research Activity

炎症惹起因子が影響するRNF213と新規結合蛋白質の相互作用変化の意義や作用機序を解明するため、RNF213欠損細胞や過剰発現細胞、また、結合蛋白質の欠損細胞やそれに結合蛋白質（野生型やユビキチン化リジン残基の変異体）を導入した細胞の遺伝子発現解析（RNA-seq）やリン酸化プロテオーム比較解析を進める。
また、上記シグナルによる血管形成について、RNF213多型モデルマウス（RNF213-R4810Kノックイン）、RNF213欠損マウスを野生型と比較し、血管形成におけるRNF213と結合蛋白質の機能解析を行う。

Causes of Carryover

目的とするRNF213新規結合蛋白質とRNF213の双方向性シグナル経路について、スクリーニング実験の結果により、遺伝子発現解析かリン酸化プロテオームの中、一つの解析を進める予定でしたが、予想と異なる結果を得ている部分があり、両方の方法で解析を行うことを決定し、次年度の予算を見直す必要があった。