Optogenetics for evaluation of neuroglial network system

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16637
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 梅林 大督 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90635575)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2026-03-31
• Keywords: チャネルロドプシン / ハロロドプシン / 神経幹細胞 / ES細胞

Outline of Annual Research Achievements

先行事業で光感受性遺伝子であるChR2遺伝子およびeNpHR3.0遺伝子導入神経幹細胞の作成のため、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入によりCSⅡ-CAG-ChR2-mVenusおよびCSⅡ-CAG-eNpHR3.0-FLAG-mRuby2を作成した。
これらのプラスミドを神経幹細胞への導入に先立って、まずは汎用されているHEK293TFT細胞にtransfectionして培養した。免疫染色、ウェスタンブロッティングにて目的遺伝子の導入を確認したが、ChR2-mVenusの認識する蛍光が再現性をもって弱いため、再度プラスミドを購入しなおして、ウイルスベクターの作成を再度行っている。
一方で、ES細胞を培養して、ES細胞からLIFを用いて直接sphere assayに切り替えてprimitive neurosphereを作成した。これらをFGF, EGFを添加して継代しdifinitive nerusosphereを作成した。免疫染色を行いprimitive neurosphereでは発現が残存していたOCT4の消失をdifinitive nerusosphereでは確認された。
しかし、difinitive neurosphereの培養効率は未だ十分ではないため、現在、培養液の添加物質を評価・検討して大量培養を計画している。
並行して、テレオプトのプローベ型光作動装置およびカニューレ型光差動装置の動作確認を行い、マウスへの埋込をすすめている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ChR2-mVenus2の認識が再現性が低く蛍光が弱いため、再度プラスミドを購入しなおしてウイルスベクターの作成を行っているため、当初の予定よりトランスフェクションへの移行が遅滞している。

Strategy for Future Research Activity

Transfectionによる死細胞の出現を想定して、神経幹細胞であるdifinitive neurosphereの大量培養を計画しいる。これにより導入効率を十分に補い研究遂行を加速させることを意図している。