2023 Fiscal Year Research-status Report

フローダイバーター留置後における血管内皮細胞再生促進因子の解明

Research Project

Project/Area Number	21K16641
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	三島有美子順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (90459082)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	血管内皮細胞 / 細胞老化 / フローダイバーター / 酸化ストレス / ァイトケミカル / 血栓溶解阻害物質 / 血管新生
Outline of Annual Research Achievements	前年度は抗酸化性成分によるPAI-1の産生抑制および老化抑制効果について検討を行った。抗酸化性成分としては、ポリメトキシフラボノイド系化合物、およびクマリン系化合物ライブラリィを中心に、抗酸化力を有する植物由来の機能性成分33種類の検討を行った。まず、老化特異的マーカーであるβガラクトシダーゼ染色による評価を行い、より老化抑制が確認された成分に関してPAI-1、SIRT1（老化抑制）、EphA2（血管新生）のqPCRを行った。結果、PAI-1の発現を減少、SIRT1の発現を上昇、EphA2の発現を減少させ得る成分を同定できた。今年度は同定したファイトケミカルの生体への投与を視野に入れた濃度調整を検討しつつ、DLL4(血管新生)についてもqPCRを行い、PAI-1の発現を減少、SIRT1の発現を上昇、EphA2の発現を減少させることが判明した。今後は、老化マーカーの一つであるp53のリン酸化をWBで、VEGF（血管新生）をELISAにより定量化していく予定である。これにより、ファイトケミカル添加による細胞内シグナル伝達経路への影響を、より詳細に考察できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 内皮細胞再生促進に寄与する植物由来の機能性成分（ファイトケミカル）の探索に時間を要した。また、初年度よりフローダイバーター上の安定的な内皮細胞培養環境の構築に着手しており、フローダイバーター上の内皮細胞被覆過程を位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡で観察した。しかしながら、フローダイバーターの形状が筒状であることや、特殊な網目構造、予期せぬ強い表面張力の力により、一定条件下での観察に難渋している。安定した血管内皮細胞被覆のためにフローダイバーターのコーティング材、血漿濃度、細胞播種量、培養方法（静置・灌流・震盪）など、現在最適化条件を引き続き検討していく必要がある。
Strategy for Future Research Activity	細胞老化には様々な要因が存在するため、今後は細胞分裂を繰り返した老化や炎症刺激による老化以外にも、TGF-βを添加して線維化(老化した血管平滑筋細胞においては、TGF-β1/p53/PAI-1シグナル伝達経路の報告がある)を加速させたモデル、MGOを与えたモデルなど、更なる老化モデルの検討を行い、ファイトケミカル投与による老化抑制効果についてより詳細に解明していきたい。前年度は、血管線維化、動脈硬化、血栓症で上昇し、老化を誘導することが知られているPAI-1遺伝子について注目し、qPCR法にて遺伝子発現の状況を確認した。細胞老化による線維化は、血管動脈内皮を使用した今回の研究に大きく関与すると考えた。いくつかの効果が期待されるファイトケミカルを血管動脈内皮細胞に作用させた結果、PAI-1の発現を抑制させる効果をもつファイトケミカルを同定した。また、同様の方法でSIRT1遺伝子の活性、EphA2遺伝子の発現減少が認められるファイトケミカルを同定した。細胞老化には様々な要因やシグナル伝達経路が存在する。まずは、代表的な老化マーカー(WBでp53, qPCRでDLL4, FACSでSA-β-gal)について調べ、その経路を調査していく。また現在、フローダイバーターを使用した安定的な細胞培養環境の確立のために準備を進めている。まずは、フローダイバーター上に細胞が安定増殖出来るよう、足場となるコーティング剤を検討中である。また、フローダイバーター上の細胞増殖の様子を評価しやすいようGFPを発現する血管内皮動脈細胞を樹立した。これにより、蛍光での観察が可能になったが、フローダイバーターの形状が筒状であることや、特殊な網目構造、予期せぬ強い表面張力の力により、観察に難渋している。来年度はこれらの課題をクリアにしていく。
Causes of Carryover	内皮細胞再生促進に寄与する植物由来の機能性成分（ファイトケミカル）の探索に時間を要した。また、初年度よりフローダイバーター上の安定的な内皮細胞培養環境の構築に着手しており、フローダイバーター上の内皮細胞被覆過程を位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡で観察した。しかしながら、フローダイバーターの形状が筒状であることや、特殊な網目構造、予期せぬ強い表面張力の力により、一定条件下での観察に難渋している。安定した血管内皮細胞被覆のためにフローダイバーターのコーティング材、血漿濃度、細胞播種量、培養方法（静置・灌流・震盪）など、現在最適化条件を引き続き検討していく必要がある。予算は、今年度も各種試薬や細胞購入として使用する。