mTOR阻害薬テムシロリムスによる椎間板変性に対する治療アプローチ

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16685
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 垣内 裕司 神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (40849212)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: オートファジー / 椎間板変性 / mTORC1阻害

Outline of Annual Research Achievements

我々のグループは椎間板髄核細胞の生存、変性の予防にはオートファジーとそれを制御するmTORシグナル経路が重要な役割を担っていると考え、ヒト椎間板髄核細胞へのmTOR阻害による細胞保護効果を報告した。細胞実験において、上記の様にヒト椎間板へのテムシロリムスの保護効果を報告したが、ヒトへの臨床応用には動物実験が必要と考えられる。
本研究では臨床応用のためラット尾椎椎間板変性モデルを作成し、椎間板内へmTORC1阻害薬であるテムシロリムスを投与した後に椎間板変性を惹起し、変性過程を観察して対照群と比較して椎間板変性度が抑制されるかを調べることとした。
まずはラット尾椎髄核細胞に対してmTOR阻害の効果を確認するためsiRNAを用いてmTOR阻害を施行し、オートファジーを評価した。siRNAによるmTORC1阻害ではオートファジーが活性されることを確認した。またテムシロリムスの投与においてもmTORC1阻害の確認とオートファジーが活性されることを確認した。
今後細胞外基質同化因子、異化因子の遺伝子発現や蛋白合成の解析を施行し、同時にラット尾椎椎間板変性モデルを作成し椎間板内へテムシロリムスを投与した後に椎間板変性を惹起し、変性過程を観察して対照群と比較して椎間板変性度が抑制されるかを調べていく予定である。具体的な内容としては椎間板変性の程度評価項目として椎間板高（レントゲン）、組織学的変化（safranin-O, H-E染色）などの椎間板構造解析を行い、さらに椎間板組織（髄核と線維輪）の細胞外基質同化因子（アグリカン、コラーゲン）・異化因子（MMPs、TIMPs）の遺伝子発現をRT-PCR法にて、蛋白合成の解析を免疫組織学的染色やウェスタンブロッティング法にて行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在はラット尾椎髄核細胞を用いてのsiRNA、テムシロリムスによるmTOR阻害の評価を施行している準備段階である。ラット尾椎髄核細胞においてもウェスタンブロッティング法によりsiRNA及びテムシロリムスの投与によりオートファジーが活性化されることが明らかになったが、細胞外基質に与える影響や細胞死、細胞老化の評価までは施行できていない。
現時点での進捗状況はラット尾椎椎間板変性モデルに対する直接投与の準備段階であり、ラット尾椎椎間板変性モデルを用いた動物実験による評価まで至っておらず、やや遅れている。今後、細胞レベルでの評価と並行しつつ動物モデルも作成し、椎間板内へテムシロリムスを投与した後に椎間板変性を惹起し、変性過程を観察して対照群と比較して椎間板変性度が抑制されるかを調べる予定である。

Strategy for Future Research Activity

ラット尾椎髄核細胞を用いてのテムシロリムスによるmTOR阻害によるオートファジーの活性化は評価できたため、今後はそれによる細胞外細胞外基質同化因子、異化因子の遺伝子発現や蛋白合成の解析を施行する。
私が以前に報告したヒト髄核細胞におけるテムシロリムスによる椎間板細胞保護効果はオートファジーの活性及びAkt の亢進によるということはラット椎間板髄核細胞では評価の途中ではある。しかし現在までのラット尾椎髄核細胞の実験結果では、ヒトと同様の効果が得られる可能性が高く、細胞実験と並行しつつ動物モデルを用いた実験をすすめる予定としている。

Causes of Carryover

コロナウイルス蔓延により学会への直接参加の減少のため旅費が予定より減少したため。
今後は学会開催が多く行われると思われるため、次年度の旅費として使用を考えている。