2023 Fiscal Year Annual Research Report
CRISPR libraryを用いた卵巣癌プロモーター制御による新規治療法の検討
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21K16800
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
山本 阿紀子 東京医科大学, 医学部, 講師 (50531224)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 癌遺伝子 / CRISPR / 卵巣癌 / プロモーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵巣癌細胞株であるOVSAHOにMYCのプロモーター領域と八放サンゴDendraに由来する蛍光タンパクを組み込んだベクターを導入し、MYCのプロモーター領域を発現するOVSAHO細胞を樹立した。この細胞はMYCのプロモータ活性が上昇すれば光照射により蛍光を発するように設計されている。この細胞に対してCRISPRLibraryを導入しMYCが過剰発現していると予想されるDendra陽性細胞をセルソーターを用い回収した。回収細胞から抽出したDNAを用いて、組み込まれたgRNAの配列を解析するといずれもMYCそのものであることが判明した。そこで、改善策としてMYCに対するgRNA結合部位を完全に欠失させたベクターを新たに作成した。OVSAHOにこの新ベクターを導入した変異株を樹立した上でCRISPRLibraryを導入し、Dendra陽性細胞を回収した。回収した細胞の一部を解析し、サンガーシーケンスでMYC以外の分子であることを確認したうえで次世代シーケンスを行い、MYCのプロモーター活性を挙げる分子の網羅的解析を行った。得られたデータより、リードカウントが1000以上である分子に対しcBioPortalの卵巣癌データベースからMYCの発現と正の相関がある15分子を抽出した。この15分子のgRNA配列を組み込んだベクターを作成し、HEK293T細胞に対しCRISPR activationの技術を用いて各分子を過剰発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。MYCのプロモーター活性が有意に上昇する分子の中から上位4分子を選択した。次いでこの4分子のoverexpression ベクターを購入し、HEKをもちいて同様にルシフェラーゼアッセイを施行し、プロモーター活性が上昇することを確認できた。一方で、MYCのmRNAレベルでの発現上昇は確認できなかった。
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