Novel Development of Gene Delivery for Inner Ear -Dual Vector Method-

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16832
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 大道 亮太郎 岡山大学, 大学病院, 医員 (20771299)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: アデノ随伴ウイルス / 内耳遺伝子導入

Outline of Annual Research Achievements

2021年度までに蝸牛が成熟している生後4週目の野生型マウスに対し、Round window membrane + Canal fenestration法（以下RWM+CF法）で２種類のAdeno associated virus (以下AAV)を内耳に導入した。血清型タイプ２（以下AAV2）、血清型タイプ９（以下AAV9）を用い、それぞれのベクターには蛍光タンパクであるeGFP（緑色蛍光）とmCherry（赤色蛍光）を組み込んだ。その際の濃度は先行研究での濃度に合わせるように、各ベクター濃度はその半分の濃度とした。具体的な濃度は以下の通りである。AAV2- EGFP at 1.84 _ 1012 GC/mL, AAV2-mCherry at 1.07 _ 1012 GC/ mL, AAV9-EGFP at 1.2 _ 1012 GC/mL, AAV9-mCherry at 1.24 _ 1012 GC/mL.。
注射後２週間目に聴性脳幹反応で聴力を評価したところ、注射された側の耳と対側の未治療の耳を比較し、低音域から高音域にかけて明らかな聴力低下を認めず、Dual transductionによる聴毒性は認めないと判断した。聴力を評価した後に安楽死させた上で、側頭骨を採取し、内耳を取り出し、固定した。今後は免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による内有毛細胞及び外有毛細胞への感染率を検討する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要で報告した通りの結果が出せており、おおむね順調に進展していると考える。
今後は、固定している内耳組織を共焦点レーザー顕微鏡で観察する予定である。

Strategy for Future Research Activity

次年度はすでに採取しホルマリン処理してある内耳を実体顕微鏡下に解剖してコルチ器のみを取り出す。さらにtectrial membraneやその他画像処理する上で支障となる異物を処理する。
蛍光抗体を用いて免疫組織学化学的処理を行い、内有毛細胞および外有毛細胞における２種類のAAVの単独感染率、重複感染率を電子顕微鏡下に観察し、その有効性を確認する。
また各々採取元のマウスのABRによる聴力結果などとも比較して聴毒性の有無なども検討する。

Causes of Carryover

報告の通り実験結果としてはおおむね順調に推移しており、反復検証が不要であったため、次年度使用が生じた。2022年度は高額な動物実験を行う予定であり、その費用に充当する予定である