Elucidation of the mechanism of volume loss in long-term transplanted cartilage - Analysis using fluorescence imaging technique

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16920
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 力丸 由起子 (西由起子) 久留米大学, 医学部, 講師 (90368960)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 脂肪由来幹細胞（ADSCs） / 軟骨再生 / 蛍光イメージング / 軟骨移植 / 電子顕微鏡解析 / 超微形態 / GFPラット

Outline of Annual Research Achievements

皮下への軟骨移植後に軟骨量の減少と皮膚の菲薄化が起こる。先行研究では、移植床組織由来幹細胞から分化誘導された軟骨細胞が、移植軟骨の中に新生するこ とを明らかにしたが、長期経過で軟骨量が減少する原因は未解明である。
本研究では蛍光イメージング手法を用いて、軟骨減少の原因を解明することを目的とす る。移植軟骨内/外の蛍光標識細胞の動態を可視化・定量解析し、(1)効率的に軟骨細胞に分化誘導される幹細胞の種類、(2)その最適付加量および(3)幹細胞の軟 骨細胞誘導能が維持される期間の解明を行う。本研究によって術後の軟骨量の減少が起こりにくく、 長期間組織量が保持される移植法の開発が可能になると考 えている。 2021と2022年度は、蛍光標識した幹細胞群を生体内で可視化するモデルの作製(蛍光イメージング)をおこなった。この実験系では、脂肪由来幹細胞(ADSCs) に幹細胞標識用超低毒性色素(PKHリンカーキット)を用いて赤色蛍光標識した。蛍光標識反応は色素濃度に依存するために事前の調製の必要がある。また、蛍光色素の細胞膜標識の至適濃度を明らかにするために、SDラット皮下脂肪組織より単離された脂肪由来幹細胞を用いて、染色液の希釈系列を作製した。この実験系 から脂肪幹細胞の蛍光イメージングに適用するPKHおよび核染色の至適濃度が明らかとなった。また、脂肪由来幹細胞の電子顕微鏡解析も合わせておこなったところ、細胞形態の異なる細胞群が存在する可能性が示唆された。幹細胞の超微形態についての情報が少なかったため、2022年度は移植前試料を用いて電子顕微鏡FIB/SEMおよびArray トモグラフィーを用いて形態解析を進めてきた。次年度は、移植モデルでの形態解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

アッセイ系の組織解析によって、幹細胞の超微形態解析を行う必要性が出てきたため、2022年度は移植前試料を用いて電子顕微鏡FIB/SEMおよびArray トモグラフィーを用いて形態解析を進めた。そのため、移植モデルでの実験系の進捗が予定より遅れ気味である。

Strategy for Future Research Activity

幹細胞を軟骨に移植するモデルを用いた組織解析を進める予定である。市販の正常ラット幹細胞を入手して蛍光イメージングおよび幹細胞シー トを作製することで、実験プロセスを短縮化しており、期間内にn数を確保する予定である。

Causes of Carryover

実験室の移転により、予定していた実験系が遂行できなかったため、次年度使用額が生じた。