次世代シーケンサーを用いた歯周炎の治療反応性を予知するGCF中miRNAの探索

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K16997
• Research Institution: Kyushu Dental College
• Principal Investigator: 笠井 信吾 九州歯科大学, 歯学部, 助教 (30878286)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: GCF / miRNA / Seq解析

Outline of Annual Research Achievements

慢性歯周炎に対して、炎症の除去を目的としてSRPを主体とした歯周基本治療が行われるが、同じ術者が歯周基本治療を行っても歯周ポケット深さが減少するケースと反応性が悪いケースが存在する。この反応性の違いについては、不明な点が多い。
歯肉溝滲出液（GCF）は歯周ポケットに存在する組織液である。歯周炎患者から採取したGCFには炎症性サイトカインが含まれ、歯周組織局所の炎症状態を反映することが知られている。miRNAは小分子RNAであり、癌をはじめとした疾患のマーカーとなることが示されている。GCF中にも様々なmiRNAが含まれていることが明らかとなったが、歯周炎の病態、並びに歯周炎の治療反応性との関連は不明である。本研究では、歯周炎患者のGCFに対して、NGS（次世代シーケンサー）を用いて、miRNA発現プロファイリングを網羅的に解析し、歯周炎病態や歯周基本治療に対する反応性に関わるmiRNA発現を明らかにし、さらに、炎症性サイトカイン発現に対する制御機構を検証することである。
令和3年度は、九州歯科大学附属病院歯周病科に初診で来院した患者より、miRNA解析のためのGCFと炎症性サイトカイン解析のためのGCFを採取した。また、miRNA解析のためのGCFからは、随時、RNA抽出を行った。患者のクリニカルパラメーターとして、PPD（歯周ポケット深さ）、CAL（クリニカルアタッチメントレベル）、プロービング時出血の有無、その他歯肉溝内縁上皮面積（PESA）・炎症歯肉内縁上皮面積（PISA）を計測した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID-19感染拡大により、本研究に適した初診の歯周病患者の来院が減少してしまったことや、歯周治療の途中で来院が途絶えてしまうなどがあり、サンプルの採取が予定通りに進まなかった。また、GCFからのRNA抽出の際に、予定していた方法では、十分な量・質のRNAを得ることができなかったため、抽出方法について再検討を行った。

Strategy for Future Research Activity

当初、歯周基本治療の予後が良好であった群（n=20）、予後が悪かった群（n=20）を予定していたが、それぞれ10サンプルへと減少させる。採取したGCFからmiRNAを抽出し、NGSによる網羅的解析を行う。miRNA発現データに対してSeq解析を行い、miRNA発現のプロファイリングを実施する。Seq解析はスーパーコンピューター上でSTAR、RSEM、DESeq2を使用して、マッピング、発現量計測、発現変動解析をそれぞれ行う。同定されたmiRNAは、RT-PCRを行い、発現を確認する。
miRNA発現プロファイルにおける発現変動遺伝子に関してGO（遺伝子オントロジー）term解析や近似した発現パターンを認める遺伝子クラスターを含んだネットワーク解析を行い、活性化されているパスウェイや上流の制御分子等を予測する。特に、歯周病患者のGCF中に含まれる炎症性サイトカインに着目し、miRNAによる制御を解明する。

Causes of Carryover

COVID-19感染拡大により、本研究に適した初診の歯周病患者の来院が減少してしまったことや、歯周治療の途中で来院が途絶えてしまうなどがあり、サンプルの採取が予定通りに進まなかった。また、GCFからのRNA抽出の際に、予定していた方法では、十分な量・質のRNAを得ることができなかったため、抽出方法について再検討を行っている段階である。これらの理由から、令和3年度より随時Seq解析が次年度に延期となり、解析費用を確保して繰り越すこととなった。
次年度は新たなサンプルを含めたSeq解析費用および学会発表、論文発表の費用が必要となる。