口腔粘膜におけるSARS-CoV-2 結合受容体の免疫応答機構の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K17116
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 鳴瀬 貴子 広島大学, 病院(歯), 助教 (20795489)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ACE2

Outline of Annual Research Achievements

新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の原因ウイルスである SARS-CoV-2 は細胞表面に存在するアンギオテンシン変換酵素 ACE2 を受容体として結合することが報告されている。ACE2 は口腔組織に発現していることが近年報告されているが，ACE2 の宿主免疫応答機構は不明である。本研究は口腔粘膜におけるウイルス感染に対するACE2 の新規宿主免疫応答機構を解明することを目的とする。2021年度，2022年度は口腔粘膜細胞におけるACE2の発現を検討した。不死化口腔粘膜上皮細胞RT7, 不死化歯肉線維芽細胞GT1 ，正常口腔粘膜上皮細胞，正常歯肉線維芽細胞の全RNAを抽出，cDNAを作成し，RT-PCR法によってACE2mRNAの発現を検討した。その結果，RT7,GT1 , 正常口腔粘膜細胞において定常的なACE2 mRNAの発現が認められた。またRT7,GT1の蛋白を抽出し，ACE2抗体を用いたWestern blotting 法によってACE2蛋白の発現を検討した。RT7,GT1において120kDの位置にACE2 蛋白のバンドが認められた。またRT7,GT1をチャンバースライドに培養し，ACE2抗体を用いた蛍光免疫染色を行った結果，RT7,GT1にACE2の局在が認められた。次にRT7, GT1 における核酸の細胞内導入によるACE2の発現誘導をReal-time PCR法にて検討した。RT7, GT1において一本鎖DNA, RNA添加，二本鎖DNA, RNA添加において両細胞におけるACE2発現誘導に変化は認められなかった。一方，一本鎖DNA, RNAの細胞内導入によっても両細胞におけるACE2 の発現に変化は認められなかったが，二本鎖DNA, RNAの細胞内導入によって著しいACE2の発現誘導が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前述のように，口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞においてACE2がRT-PCR 法，Western blotting 法によってmRNA ，蛋白のレベルで発現していることが示された。またACE2 が口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞の細胞膜に局在していることが明らかになった。さらに口腔粘膜上皮細胞，線維芽細胞において二本鎖核酸の細胞内導入によってACE2 の発現が増加することが示された。今回の結果から概ね順調に進行していると考える。

Strategy for Future Research Activity

2023年度は口腔粘膜細胞におけるACE2の発現誘導のメカニズムを検討する。RT7, GT1 にTNF-α, IFN-γ などの炎症性サイトカインや各種Toll-like receptor ligandなどの微生物構成成分を添加することによるACE2の発現誘導をReal-time PCR法, Western blotting 法によって検討する。二本鎖核酸によって誘導されるACE2に対するNF-kB, STAT1, MAPKなどの各種阻害剤の影響を検討し，ACE2発現に関連するシグナル伝達経路を検討するさらにACE2 欠損による抗ウイルス関連遺伝子発現の影響を明らかとするため，RT7, GT1 で誘導が認められた ACE2 を特異的細胞内受容体 siRNA や中和抗体で抑制した際の誘導されるIFN-βなどの抗ウイルス関連遺伝子の影響を Real-time PCR法, ELISA 法にて検討する予定としている。

Causes of Carryover

2022年度はACE2の局在を明らかにするのに時間を要し、サイトカインや抗体の購入が少なかったため、次年度使用額が発生した。2023年度に予定している口腔粘膜細胞におけるACE2の発現誘導のメカニズムの検討を行う過程で使用するサイトカインやPCRキット，抗体等の購入に使用予定である。