2022 Fiscal Year Research-status Report
３次元組織培養モデルによるコラーゲンライブイメージングを用いた肝線維化機構の解析
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21K18051
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
守矢 恒司 東京工業大学, 生命理工学院, 研究員 (60833556)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | I型コラーゲン / イメージング / 肝星細胞 / 細胞培養モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、所属グループで開発された「可視化I型プロコラーゲン発現システム」を利用した3次元肝臓組織培養モデルを構築し、コラーゲン分子の視点から肝線維化発症機構を解明することを目的としている。肝臓内での持続的な炎症反応により静止期の肝星細胞が活性化することで、コラーゲンが過剰産生され、肝線維化が発症する。これまでに、生理的発現量およびサイトカインなどの外部因子に対する応答性を有する「第2世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」の開発を実施した。この「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」を導入した線維芽細胞では、コラーゲンの転写活性を促進するサイトカインTGF-β1で刺激することで、細胞内蛍光輝度の上昇し、および細胞内タンパク質発現量の増加が認められた。構築した「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」が外部因子に対する応答性を有することを確認した。
2022年度は、「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現」ベクターを、異なる活性化状態を示す2種類のラット肝星細胞株に遺伝子導入し、FACSによるシングルセル単離および薬剤選択により、安定発現株の樹立をおこなった。これにより各細胞株に対し、可視化I型プロコラーゲンを恒常的発現する細胞株を複数取得することに成功した。取得した細胞株は、活性化因子であるTGF-β1により、活性化マーカーであるαSMA遺伝子発現量の増加や静止期マーカーであるPpar-γ遺伝子発現量の低下がみられたことから、親株と同等の性質を保持していた。またTGF-β1による活性化誘導で、可視化I型コラーゲン由来の細胞内蛍光輝度の増加が認められ、かつ、細胞外への分泌量変化も検出されたことから、可視化I型プロコラーゲン発現肝星細胞の樹立に成功したと考える。現在、樹立細胞株を血管内皮細胞との共培養による、3次元組織培養モデル構築を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
可視化I型プロコラーゲン安定発現肝星細胞株の樹立およびその機能解析が完了し、組織培養モデルの構築に着手できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立した可視化I型プロコラーゲン安定発現肝星細胞株を、肝実質細胞、血管内皮細胞と共培養させた3次元肝臓組織培養モデル構築を実施し、肝線維化を誘導した際のコラーゲン生合成過程変化を生化学的およびイメージング解析より追跡する予定である。
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| Causes of Carryover |
動物実験計画を再考したため、動物実験分の予算を繰り越すこととなった。動物個体での検討のみならず、ヒト個体でみられる肝機能を反映した細胞培養モデルの構築も検討していることから、ヒト初代培養肝細胞もしくは、それに準ずる機能を保有する肝実質細胞の購入を予定している。以上のことから、繰越額と2023年度計画予算分を用いて、研究を進める。
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