2023 Fiscal Year Research-status Report

３次元組織培養モデルによるコラーゲンライブイメージングを用いた肝線維化機構の解析

Research Project

Project/Area Number	21K18051
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	守矢恒司東京工業大学, 生命理工学院, 研究員 (60833556)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	I型コラーゲン / イメージング / 肝星細胞 / 細胞培養モデル / 肝線維化
Outline of Annual Research Achievements	本課題は、難治性疾患に指定されている肝線維化の発症機構を、I型コラーゲン分子の視点から解明することを目的としている。肝臓内での持続的な炎症反応により静止期の肝星細胞が活性化することで、コラーゲンが過剰産生され、肝線維化が発症する。所属グループでは、コラーゲンを分子・細胞レベルで追跡できる、「可視化I型プロコラーゲン発現システム」を開発し、イメージング解析よりコラーゲン分子を追跡できるだけでなく、コラーゲンのプロセシング状態を識別できることが可能となった。本システムを導入した肝星細胞を用い、肝線維化抑制因子を探索するための3次元組織培養モデル構築を進めている。 2023年度は、昨年度に樹立した「第２世代可視化I型プロコラーゲンα1」安定発現ラット肝星細胞株 (以下Gr-CC/CFSC-2G) を用いて、抗線維化薬の探索系構築を実施した。細胞内の可視化I型プロコラーゲンα1タンパク質由来のGFP蛍光強度を測定することにより、活性化状態を評価でき、かつ、培養上清中のGFP蛍光強度を測定するにより、分泌コラーゲンの簡便な検出及び定量測定が可能となった。星細胞活性化状態および分泌コラーゲン量評価系が構築できたため、本評価系を用いて既存の抗線維化薬の薬効を検討したところ、有意に細胞内コラーゲン発現量および細胞外分泌量の抑制が認められた。また並行して肝星細胞活性化に伴い、３種類の細胞内輸送関連タンパク質について発現変動が認められた。コラーゲン分泌制御にかかわっているかどうか、次年度に解析を進める予定である。現在、Gr-CC/CFSC-2G細胞および血管内皮細胞（HUVEC）との共培養による、3次元肝類洞モデル構築ができたため、肝実質細胞を含めた、共培養モデルの構築も次年度に進めていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 可視化I型プロコラーゲン発現肝星細胞株、および血管内皮細胞株を用いて、肝類洞構造を模倣する細胞培養モデルの構築ができた。また肝星細胞活性化に伴い、コラーゲンの分泌に関与する可能性のある新たな3つの細胞内輸送関連タンパク質をあげることができたため。
Strategy for Future Research Activity	樹立した可視化I型プロコラーゲン安定発現肝星細胞株を、肝実質細胞、血管内皮細胞と共培養させた3次元肝臓組織培養モデル構築を実施し、肝線維化を誘導した際のコラーゲン分泌量変化やC-プロペプチドプロセシング状態の変化をイメージング解析より追跡する予定である。また、N-プロペプチドおよびC-プロペプチドのプロセシング評価可能な、「第２世代可視化I型プロコラーゲンα1」発現ベクターを導入した肝星細胞 (GN-CC/CFSC-2G) の樹立を進め、肝線維化発症における両末端プロペプチドのプロセシング状態を解析可能な評価系の構築も進める。
Causes of Carryover	本年度の実験計画を見直し、動物実験をやめたことから概算した予算分を繰り越すこととなった。次年度では、ヒト個体でみられる肝機能を反映した細胞培養モデルの構築に切り替えたことから、ヒト初代培養肝細胞もしくは、それに準ずる機能を保有する肝実質細胞を購入し、解析を進める。また、2024年度に異動することが決まったため、異動先での実験環境を整えるための予算が必要となった。以上のことから、繰越額と2024年度計画予算分を用いて、研究を進める。