2021 Fiscal Year Research-status Report
Proposing regulatory mechanisms of innate immune system manipulated by cancer-derived extracellular vesicles
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21K18248
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
辻川 和丈 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (10207376)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | がん / 細胞外小胞 / 単球 / RNA修飾 / 炎症性サイトカイン / Toll様受容体 / がん細胞増殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、がん細胞が細胞外小胞（Extracellular Vesicle: EV）内のRNA修飾体バランスを正常細胞と変えて放出することにより単球や腫瘍関連マクロファージのToll-like receptor (TLR)に非自己として認識させ、自然免疫系を活性化させることによりサイトカイン産生を介してがん細胞有意な微小環境へと誘導する戦略を取っていることを、がん術後組織由来EVと独自基盤技術の活用により検証することを目的とした。
本年度、大腸がん術後臨床検体を用いた解析により、①がん部由来EVは非がん部由来EVに比べRNA修飾塩基レベルが顕著に低下していること、②がん部由来EVは非がん部由来EVと比べ単球に取り込まれた後、炎症性サイトカインであるTNF-αやIL-6の産生を上昇させること、③がん部由来EVはTLR8を介したシグナル伝達によりそれらサイトカイン産生を上昇させることを明らかにした。また次世代シークエンサーを用いてEV中のRNAの解析を行ったところ、tRNAの分解産物である5’-tRNA fragment（5’-tRF）が高レベルに存在していることを突き止めた。特に5’-tRF-GlyGCCが豊富に搭載されていることを認めた。さらにこの5’-tRF-GlyGCCを合成し、マクロファージに取り込ませたところ炎症性サイトカイン産生が促進され、その作用はsiRNAによるTLR8のノックダウンにより減弱することも突き止めた。
これらの結果は、がん細胞はEV中のRNA塩基の修飾レベルやRNAの種類を変えることによりTLR8を介した免疫機能攪乱を誘導させ、がん細胞増殖を優位にさせる機構を発現していることを初めて明らかにしたものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
大腸がん術後組織を用い、がん部と非がん部のEVを取得して利用することにより、「がん細胞がEV内のRNA修飾体バランスを正常細胞と変えて放出することにより単球や腫瘍関連マクロファージのTLRにあえて非自己として認識させ、自然免疫系を活性化させることによりサイトカイン産生を介してがん細胞有意な微小環境へと誘導する戦略を取っている」という当初の仮説を証明するとともに、TLR8がそのサイトカイン産生誘導に重要な役割を示すことができた。さらに、がん細胞はEV中にtRNAの断片である5’-tRF-GlyGCCを特徴的に包含させ、単球のTLR8を介したシグナル伝達を促進させることも突き止めた。
大腸がんEV中にtRNAの分解産物である5’-tRF-GlyGCCを高レベルで存在さえ、免疫機能を攪乱させる戦略は予想できないがん細胞の戦略であり、その発見は当初の計画以上の進展となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸がんEVが単球における炎症性サイトカイン産生を促進することにより大腸がん細胞の増殖能が亢進することが明らかとなったが、その詳細な機構は明らかとなっていない。既報としてTNF-αおよびIL-6 がSTAT3を介してがん細胞の増殖能を亢進していることが報告されている。そこで単球培養上清に対してTNF-αやIL-6 を抗体を用いて中和することによりがん細胞の増殖能の亢進がキャンセルされるか検証することで炎症性サイトカインによるがん増殖の亢進作用を明確とする。またがん微小環境ではマクロファージが重要な役割を演じていることが報告されている。マクロファージはM1型とM2型に分類される。そこでM1/M2マクロファージを用いて今年度得られたがんEVの機能を検証する。
In vitroで得られた結果ががん組織レベルでも認められることかを明らかとする必要がある。すでに大腸がんや他がん種のがん術後検体が取得できており、それらのパラフィンブロックの作製も進めている。そこでRNA修飾体抗体やマクロファージマーカーと活性化TLRシグナル伝達分子に対する抗体を用いて、免疫染色を行い、がん組織レベルでの確認を行う。
これらの検討により、がんEVの腫瘍関連マクロファージを介した免疫攪乱作用とがん細胞優位への誘導機序の存在を明示することができる。またin vivoにおける評価が重要となる。そこでがん術後検体を免疫不全マウスに移植するpatient-derived xenograft（PDX）マウスの樹立を形成された腫瘍の解析を開始する。
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| Causes of Carryover |
設備備品費の機種選定において予定より150万円安く購入できた。また消耗品に関しても効果的使用を心がけることにより、2021年度は予想以上の成果を上げながら効率的な利用を達成した。そこでこの経費を翌年度の研究の加速のための設備備品（インキュベーションモニタリングシステム CM20）に充てることにより、さらなる研究の展開が期待できると判断し、使用計画を変更した。
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Research Products
(3 results)
