2022 Fiscal Year Research-status Report

DNA1本鎖損傷により誘導される染色体構造異常発生機構の解明

Research Project

Project/Area Number	21K18314
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	中田慎一郎大阪大学, 高等共創研究院, 教授 (70548528)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2025-03-31
Keywords	CRISPR/Cas9 / ニッカーゼ / 大規模欠失 / ノックアウト
Outline of Annual Research Achievements	染色体構造異常は悪性腫瘍で多く認められる。染色体構造異常の種類は様々であるが、異なる2つの染色体が融合する染色体転座や染色体上で大きな領域が欠失してヘテロ接合性の喪失に至ることがある。一方、gain of functionやdominant negative効果が原因となるAutosomal Dominant疾患において、変異アレル特異的に大規模欠失を発生させることができれば、その疾患が治癒する可能性がある。DNA2本鎖切断（DSB）を用いずにDNA1本鎖切断であるニックを用いて、目的外変異が発生しないようにlong deletionを発生させ、その分子機構の解明や正確性の検証を行ってきた。昨年度に引き続き、DNA2本鎖のそれぞれに1カ所ずつニックを発生させることにより、long deletionの誘導を行った（以下MN-LD法）。昨年度検証に用いた遺伝子に加え、X染色体上の遺伝子（使用した細胞は男性由来の細胞）において、MN-LD法を実施し、約50%の細胞においてlong deletionを発生させることができた。また、遺伝子Aの5′UTRにおいてcoding鎖に、3′UTRにおいてnon-coding鎖にニックを発生せさせたところ、計画通りのlong deletionの発生が確認され、遺伝子全長の削除も可能であることが示された。ニッカーゼとsgRNA2種類を組み合わせた場合、野生型Cas9とsgRNA2種類を組み合わせた場合とに分け実験を実施した。シングルセル由来クローンを作成し、long deletionが発生した細胞において遺伝子のbreakpointの特徴をサンガーシーケンス法により解析した。その結果、マイクロホモロジーが検出される割合が高いことが示された。DSBを2カ所発生させて同様の実験を実施した場合には、マイクロホモロジーの頻度はこれよりも低く、DNA損傷の種類によりDNA断端の結合様式が異なることが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度中に、昨年度に確立した実験手法を利用して、MN-LD法により様々な遺伝子においてlong deletionを発生させることが可能であることを実証した。また、MN-LDが少なくとも8kbのdeletionを可能とすることを示した。MN-LDが発生する分子機構の解析を次年度以降に実施していくが、その際に重要となる知見として、long deletionが発生する際のbreakpointの配列の特長がnickを用いた場合とDSBを用いた場合とで異なることを示した。これらのことから、順調に研究が実施できていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	DNA修復には、DNAに関わる細胞代謝、例えば、複製や転写が影響を及ぼす可能性がある。特に、複製がニックに衝突してDSBに変換され、この断端が結合することでlong deletionが発生する可能性は十分にあると考えられる。その一方で、breakpointの結合様式はnickを発生させた場合とDSBを発生させた場合とで異なっており、DSBへの変換を伴わないままにlong deletionが発生している可能性もある。当然、両方の機構が機能している可能性もある。複製を停止させた状態であってもlong deletionが発生しうるか、検証を進めていく。また、様々なDNA損傷応答関連遺伝子の欠損細胞においてMN-LDの発生頻度を検証することで、MN-LDの分子機構を解明していく。
Causes of Carryover	当初予定していた方法よりも実験のスケールを数分の1に小さくすることができたため、実験1回あたりのコストを大きく削減することができた。本研究に参加する研究員を内部資金により雇用することができたため、人件費の支出を行わなかった。翌年度には、再現性を確認する実験、これまでとは実験条件を変え、異なる視点から実験結果を検証するための実験に利用していく。世代シーケンサーを利用したbreakpointの配列解析を実施していく予定としている。また、実験補助者を採用し、研究を効率的に推進していく予定である。