2022 Fiscal Year Research-status Report
クライオ電子顕微鏡解析に基づく酵素―電極間直接電子移動制御型センサの開発
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21K18321
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80323103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | フラボシトクロムb2 / シトクロム c / 直接電子移動 / クライオ電子顕微鏡解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、汎用的な血中バイオマーカーの連続計測を可能とする酵素―電極間直接電子移動 (Direct Electron Transfer, DET) 制御型センサの開発を目的としている。具体的には、電極へのDET能を有するフラボシトクロムb2 (Fcb2)－シトクロム c (Cyt c) にそれぞれ抗体断片を融合させ、バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とするセンサの開発を目指している。本年度は、主に1) Fcb2 とCyt cのクライオ電子顕微を用いた構造解析、と2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合、の観点から研究を進めた。
1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析
バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とする新規センサの開発にはFcb2とCyt cの相互作用部位の特定が重要である。昨年に引き続き、それぞれ大腸菌発現系を用いて調製したFcb2とCyt cを量論的に混合させた後、クライオ電子顕微鏡解析を行った。結果、Fcb2の四量体構造を示す電顕像は得られたものの、Fcb2とCyt cの相互作用部位の特定には至らなかった。今後は、濃度比を変えて再測定する予定である。
2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合
クライオ電子顕微鏡を用いたFcb2 とCyt cの精密構造は得られていないが、既報の構造を基に、抗体断片を融合させるための連結モジュールの導入位置を決定した。それぞれ、連結モジュール融合分子を設計し、大腸菌発現系を用いて調製した。精製後の分子を用いて機能評価を行った結果、いずれも連結モジュール融合後もFcb2 とCyt cの本来の機能を保持していることが確認された。また、いずれも抗体断片との複合体化を行ったところ、高効率な複合体化、かつ抗体の機能を保持していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度研究を進めた、1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析、に関して、Fcb2の四量体構造を示す電顕像は得られたものの、Fcb2とCyt cの相互作用部位の特定には至らなかった。一方で、2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合、に関して、既報の構造を基に、抗体断片を融合させるための連結モジュールの導入位置を決定し、それぞれ連結モジュール融合分子を大腸菌発現系を用いて調製することに成功した。精製後の分子を用いて機能評価を行った結果、いずれも連結モジュール融合後もFcb2 とCyt cの本来の機能を保持していること、また、抗体断片との複合体化後も、それぞれの機能を保持していることが確認された。
以上、研究の進捗を総合的に判断し、おおむね順調に進展している、とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とする新規センサの開発に向けて、引き続き、1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析、を進めると共に2) 構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合、では、実際にこれまでに調製に成功しているセンシング素子を用いて新規測定系の構築を目指す。モデルバイオマーカーの検出に成功した後は、DET効率の変化を測定原理とする新規センサ、即ち電気化学センサへの構築へと展開させる。
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| Causes of Carryover |
構造情報に基づくFcb2 とCyt cへの抗体断片の融合において、当初は複数の融合位置を検討する予定であったが、初期融合デザインに、期待する機能がほぼすべて揃っていることが確認されるなど、順調に研究が進行したため次年度使用額が生じた。次年度使用額は、クライオ電子顕微鏡解析に向けた融合分子の大量調製に係る消耗品、および構造解析に係る人件費に主に充当する予定である。
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[Journal Article] Functional characterization of 12 dihydropyrimidinase allelic variants in Japanese individuals for the prediction of 5-fluorouracil treatment-related toxicity.2023
Author(s)
Hishinuma E, Narita Y, Rico E. G, Ueda A, Obuchi K, Tanaka Y, Saito S, Tadaka S, Kinoshita K, Maekawa M, Mano N, Nakayoshi T, Oda A, Hirasawa N, and Hiratsuka M.
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Journal Title
Drug Metabolism and Disposition
Volume: 51
Pages: 165-173
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] An ancestral function of strigolactones as symbiotic rhizosphere signals.2022
Author(s)
Kodama K, Rich k, Yoda A, Shimazaki S, Xie X, Akiyama K.,Mizuno Y, Komatsu A., Luo Y, Suzuki H, Kameoka H, Libourel C, Keller J, Sakakibara K, Nishiyama T, Nakagawa T, Mashiguchi K, Uchida K, Yoneyama K, Tanaka Y, Yamaguchi S, Shimamura M , Delaux P, Nomu
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13
Pages: 3974
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A marine sponge-derived lectin reveals hidden pathway for thrombopoietin receptor activation.2022
Author(s)
Watari H, Kageyama H, Masubuchi N, Nakajima H, Onodera K, Focia PJ, Oshiro T, Matsui T, Kodera Y, Ogawa T, Yokoyama T, Hirayama M, Hori K, Freymann DM, Komatsu N, Araki M, Tanaka Y, Sakai R.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13
Pages: 7262
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Crystal structure analysis of LanK complexed with landomycinA, a potent antitumor antibiotic2022
Author(s)
Atsushi Tsugita, Shiro Uehara, Takashi Matsui, Takeshi Yokoyama, Iryna Ostash, Maksym Deneka, Subbarao Yalamanchili, Clay S. Bennett, Bohdan Ostash, and Yoshikazu Tanaka
Organizer
e-Asia Joint Symposium on “Marine Biodiversity as a Source of New Chemotypes”
Int'l Joint Research
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