2023 Fiscal Year Research-status Report
クライオ電子顕微鏡解析に基づく酵素―電極間直接電子移動制御型センサの開発
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21K18321
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
浅野 竜太郎 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (80323103)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | フラボシトクロムb2 / シトクロム c / 直接電子移動 / クライオ電子顕微鏡解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、汎用的な血中バイオマーカーの連続計測を可能とする酵素―電極間直接電子移動 (Direct Electron Transfer, DET) 制御型センサの開発を目的としている。具体的には、電極へのDET能を有するフラボシトクロムb2 (Fcb2)－シトクロム c (Cyt c) にそれぞれ抗体断片を融合させ、バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とするセンサの開発を目指している。本年度は、主に1) Fcb2 とCyt cのクライオ電子顕微を用いた構造解析、2) 電気化学センサの構築と本センサの汎用性の検証、3) Fcb2 とCyt cの共固定化条件の最適化の観点から研究を進めた。
1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析: 昨年に引き続き、クライオ電子顕微鏡解析を進めた。解析条件等を検討した結果、Fcb2とCyt cの会合量論比を得ることに成功した。文献情報と齟齬がなく、またマスフォトメトリー解析の結果とも相関していた。今後は、抗体断片を融合させたFcb2 、あるいはCyt cを用いた精密解析を進める予定である。
2) 電気化学センサの構築と本センサの汎用性の検証: 抗体断片融合Fcb2 とCyt cを用いて、センサの開発を進めた。電気化学検出に先駆けて、Cyt c中のヘムの還元に伴う吸光度変化を指標としたセンサの開発を行った。結果、標的抗原に依存したシグナル変化が見られたが、再現性には乏しかった。今後は、センサ構築時の抗体断片融合Fcb2 とCyt cの量論比の検討などを行う予定である。
3) Fcb2 とCyt cの共固定化条件の最適化: 電気化学検出に向けて、金電極上へのFcb2 とCyt cの共固定化条件の検討を行った。結果、非共有性の試薬を用いて固定化した際に、Cyt cを介したFcb2の応答電流の向上が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度研究を進めた、1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析、に関して、複合体の精密構造は得られてはいないものの、Cytcに由来すると思われるマップがFcb2の近傍に確認することでき、得られたマップの形状から複合体の会合量論比を見積ることに成功している。今後、抗体断片を融合させたFcb2 、あるいはCyt c を用いた複合体の精密機能解析に期待が持たれる。2) 電気化学センサの構築と本センサの汎用性の検証、に関して、電気化学センサの構築に先駆けて、ヘムの還元に伴う吸光度変化を指標としたセンサの開発を行ったが、標的抗原に依存したシグナル変化は観察されたものの、再現性には乏しかった。3) Fcb2 とCyt cの共固定化条件の最適化、に関して、非共有性の試薬を用いて金電極に固定化した際に、Cyt cを介したFcb2の応答電流の向上が認められたが、連続計測を見据えると共有結合性の固定化が望まれる。
以上、研究の進捗を総合的に判断し、おおむね順調に進展している、とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
バイオマーカー依存的なDET効率の変化を測定原理とする新規センサの開発に向けて、引き続き、1) Fcb2とCyt cのクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析、を抗体断片融合分子も用いて進めると共に2) 電気化学センサの構築と本センサの汎用性の検証、では再現性の高い抗体断片融合Fcb2 とCyt cの量論比の決定など、測定条件の検討を進める。3) Fcb2 とCyt cの共固定化条件の最適化、では共有結合で固定化させるための自己組織化単分子膜 (SAM) の検討を電極との距離も考慮しつつ進める。
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| Causes of Carryover |
Fcb2 とCyt cの共固定化条件の検討において、非共有性の試薬を用いて金電極に固定化した際に、期待するCyt cを介したFcb2の応答電流の向上が認められるなど、順調に研究が進行したため次年度使用額が生じた。一方で、連続計測を見据えると共有結合性の固定化が望まれるため、次年度使用額は、共有結合で固定化させるための各種自己組織化単分子膜 (SAM) の検討に係る消耗品、および引き続き構造解析に係る人件費に主に充当する予定である。
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