2022 Fiscal Year Research-status Report

高機能化液化色素ナノ油滴に基づく超高感度1ステップ診断デバイスの新原理創発

Research Project

Project/Area Number	21K18986
Research Institution	Osaka Metropolitan University
Principal Investigator	久本秀明大阪公立大学, 大学院工学研究科, 教授 (00286642)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2024-03-31
Keywords	イオン液体 / 色素液体 / アルカリフォスファターゼ / ナノエマルション
Outline of Annual Research Achievements	本提案では近年我々が見出した油水界面酵素反応と高機能化色素液体ナノ油滴で、超高感度1ステップタンパク検出の新原理に直結する酵素検出用新規超高感度変色原理開拓を目的とする。今年度は昨年度原理検証に成功したクマリン誘導体を用いて混合比等の条件検討を進めた。しかしながら得られる蛍光強度変化のわずかな変化はあるものの、それ以上の変化が得られなかったことから、この分子を用いた実験系で応答の劇的な改善につなげることは困難と判断し、カチオン性蛍光色素であるアルキル化アクリジンオレンジ（AO）の利用を検討した。AOは疎水性環境では大きな発蛍光を示し、親水環境では蛍光強度が下がるため、油水界面酵素反応に伴うAOの界面付近への移動に伴う蛍光強度変化が期待できる。また、カチオン性の蛍光色素は有機相内のカウンターアニオンがスルホン酸アニオンなどの局在化アニオンの場合と、テトラフェニルホウ酸誘導体（TFPB）などの非局在化アニオンの場合で吸収スペクトルが大きく異なることがわかってきているため（Chem. Sci., 2021, 12, 15596）、この変化も利用できると考えた。ここではAOと、TFPBとのイオン対、および、アルカリフォスファターゼの基質となるリン酸誘導体（Naphthol AS TR phosphate）と疎水性テトラアルキルホスホニウムカチオンとのイオン対をそれぞれ合成した。これらのイオン対同士を混合した色素液体ナノ油滴を調製し、油水界面でのアルカリフォスファターゼとの酵素反応に伴うスペクトル変化を評価した。現在、基質分子由来の吸収スペクトルが変化していることから、油水界面酵素反応が起こっていることが確認できている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 昨年度まで検討していた分子の反応系から、異なる蛍光分子の反応系に変更する必要性が発生したため、新たに分子の合成が必要となった。実際の実験を進めるうえで必要となるまとまった一定量の分子合成に時間をとられてしまったため。
Strategy for Future Research Activity	現在進めているアルキル化アクリジンオレンジの反応系について、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルから検討するとともに、ナノ油滴の疎水性を制御するためにセバシン酸ジオクチルのような疎水性液体を添加した反応系も検討し、酵素反応に伴う大きな蛍光強度変化の達成を目指す。また、以前に我々が用いていた蛍光性クマリン誘導体のリン酸化体基質は、ナノ油滴に用いた場合に油水界面酵素反応に基づく基質消費率がほぼ9割以上となることが分かっているため（Analyst, 2021, 146, 4121）、反応機構の検証にこの分子を用いることも検討している。
Causes of Carryover	理由：　研究が遅れている理由にも記載したように、実験の過程で新たに検討する必要のある分子の合成を行うこととなった。したがって、その検討に必要な金額および、その先の検討を実施するための費用や成果報告の旅費等を確保する必要があったため。使用計画：　上記の検討に必要な試薬・器具等の物品費および、その検討過程の成果を学会等で報告するための旅費として使用する。