2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of Trojan horse-type cancer therapeutics by elucidating and utilizing the predation mechanism of pancreatic cancer cells
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21K19036
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
高野 勇太 北海道大学, 電子科学研究所, 准教授 (60580115)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮武 由甲子 北海道大学, 医学研究院, 助教 (10421984)
山田 勇磨 北海道大学, 薬学研究院, 准教授 (60451431)
繁富 香織 北海道大学, 高等教育推進機構, 特任准教授 (90431816)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| Keywords | すい臓癌 / 量子ドット / 細胞死 / 光治療 / 光がん治療 / 活性酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は当初計画通り、「[段階-I] 捕食誘引物質の粗分離、観察、構造決定による同定」にとりかかり、膵がん細胞の死細胞を調製した上で捕食誘引物質の分離を開始した。まず、死細胞について大きく「アポトーシス様死細胞」と「ネクローシス様死細胞」に分けて調製し、それぞれ膵がん細胞より再構築したミクロ組織3次元と共培養しながらリアルタイム顕微鏡観察を行い、取り込まれる挙動の観察を行った。この際、コントロール条件として1μm（大体アポトーシス死細胞と同サイズ）のCOOH修飾蛍光ビーズを用いた。結果、COOH修飾蛍光ビーズでは細胞への取り込み、特に細胞集団が触手を伸ばすなどの能動的な取り込みは起きないことを確認した。そして「アポトーシス様死細胞」と「ネクローシス様死細胞」は両者とも取り込まれることを確認したが、ネクローシス様死細胞では取り込みがやや少ない傾向にあった。これはネクローシスでは死細胞構造がランダムであるとともに、細胞内容物が維持できないことが一因であると考えられた。よって、今後の検討は主にアポトーシス様死細胞で行うこととした。現在は、アポトーシス様死細胞の大量調製と、粗分離を開始したところである。
また、「[段階-II]捕食誘引物質を複合化した高薬効性の光がん治療薬の合成開発」の準備段階として、量子ドットに近赤外光殺がん分子(rTPA)を接合した複合体や、ドラッグデリバリキャリアとrTPAの複合化も行い、その一重項酸素発生能および光殺がん効果を確認した。本研究の遂行によってドラッグデリバリキャリアとrTPAの相性により、内容分子の機能性（本研究の場合は光殺がん性能）が変化することが分かった。今後、最適化を進め最大効率で殺がん効果を示す複合体プロトタイプを作成し、本研究の目的とするトロイの木馬型殺がん化合物を完成させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初計画通り、「[段階-I] 捕食誘引物質の粗分離、観察、構造決定による同定」にとりかかり、膵がん細胞における「アポトーシス様死細胞」と「ネクローシス様死細胞」を調製した上で捕食誘引物質の分離を開始した。結果、ネクローシス様死細胞では取り込みがやや少ない傾向にあることを見出し、今後の検討は主にアポトーシス様死細胞で行うことと決定した。現在は、アポトーシス様死細胞の大量調製と、粗分離を開始したところである。
また、「[段階-II]捕食誘引物質を複合化した高薬効性の光がん治療薬の合成開発」の準備段階として、量子ドットに近赤外光殺がん分子(rTPA)を接合した複合体を合成し、その一重項酸素発生能および光殺がん効果を確認した。一方、ドラッグデリバリキャリアとrTPAの複合化も行い、in vivoでの殺がん効果検証を進めるとともに、rTPAについて分子変換を行ったうえでのドラッグデリバリキャリアとの最適な組み合わせ探索も開始した。本研究の遂行によってドラッグデリバリキャリアとrTPAの相性により、内容分子の光殺がん性能が変化することが分かった。今後、最適化を進め最大効率で殺がん効果を示す複合体プロトタイプを完成させる。また、量子ドット単体では、光照射により表面エッチングが起こり、毒性が発現する可能性があるため、表面をシリカコートした量子ドットを調製し、rTPAとの複合化および殺がん効果の検証も行っている。量子ドットに直接rTPAを付けるよりも、シリカコート量子ドットとrTPAを複合化した方が、望まぬ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を抑制でき、高い一重項酸素発生能および殺がん効果が見られることが分かった。これらの知見を基に、本段階IIの目的とするトロイの木馬型殺がん化合物として完成させる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当初計画通り「[段階-I] 捕食誘引物質の粗分離、観察、構造決定による同定」をすすめ、現在おこなっているアポトーシス様死細胞からの捕食誘引物質の単離生成と同定・構造決定を行う。具体的に、膵がん細胞（ＰＣＩ５５細胞）を10分間の紫外線光照射のち37℃インキュベートによってアポトーシス誘導した細胞について、サイズ排除クロマトグラフィーによる分子サイズ分画を行った後、小～中分子サイズ（1kDa～50kDaを想定）をいくつかの分画に分け、さらに極性カラムによる分画を行う。ここで小～中分子サイズに限定した理由は、これ以上の大サイズ分子では非特異的な吸着や細胞選択が起こる可能性が示唆されたためである。分画成分をシリカコート量子ドットあるいは蛍光ビーズと複合化し膵がん細胞集団による捕食を種々の条件(捕食させる死細胞の種類、がんの進行度、酸素濃度などの培養条件) を変化させながらライブイメージング解析し、膵がん細胞による捕食の条件や選択則をコントロールする要素を見つけだす。これにより、膵がんにおける捕食のメカニズム解明と最適化条件設定を試みると同時に、次段階「[段階-II]捕食誘引物質を複合化した高薬効性の光がん治療薬の合成開発」のがん治療薬開発に利用する。
段階-IIとして、前段階(I)で同定した捕食誘引物質を、rTPAをはじめとする光殺がん化合物と複合化し、膵がんに取り込まれやすい光線がん治療薬を開発する。捕食誘引物質を化学修飾により接合した殺がん化合物を合成する。そして、3D培養膵がん組織中およびマウスin vivo実験における取り込み効率・光照射殺がん効果の評価を行い、新規光がん治療薬の開発を達成する。
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| Causes of Carryover |
3次元培養に用いる基板について、研究開始前にあらかじめ作成済であったものを使用することが出来たため、この作成費および各種検証に見込んでいた予算が未使用となった。また、量子ドット原料について、市販品の購入利用を当初見込んでいたが、共同研究者による無償提供で賄うことができたため、予算未使用となった。また、動物実験に関しても初年度は実施せず、2年目に集中的に行うこととしたため、関連予算を未使用とした。
これら次年度使用額については、まず3次元培養に用いる基板の作成及び改良のために支出する予定である。基板材料の改良選定や、多ウェルプレート型の試作および実証を予定しいる。そして、動物実験についても、集中的な実施を計画している。
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Research Products
(14 results)
