2023 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Semisynthetic Probe for Imaging ER stress
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21K19048
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 九州大学, 理学研究院, 教授 (00444563)
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2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | ミスフォールディング / スイッチ機能 / UGGT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT)は、ミスフォールディングしたタンパク質を結合するタンパク質であり、その結合部位に蛍光色素も結合する。このことから、ミスフォールディングタンパク質の結合に伴い色素の蛍光強度が変化するスイッチ機能を持つ分子プローブを設計すれば、ミスフォールディングタンパク質を検出できると考えた。そこで、本研究では、UGGTにPYPタグを融合し、スイッチ機能を持つ蛍光色素で標識したSemisyntheticプローブを開発した。これまでの研究で、UGGTのN末端にPYPタグを融合させたPYP-UGGTの遺伝子をクローニングした。一方、この遺伝子を大腸菌で発現させようとしたものの、その発現量が少なく、発現量向上が課題であった。本年度の研究では、UGGTのN末端ではなく、C末端にPYPタグを融合した遺伝子を作成し、遺伝子発現を試みた。これらの遺伝子には、HisタグおよびGSTタグをN末端に融合させておき、これらのタグを利用してタンパク質を精製することとした。大腸菌にて遺伝子発現を行ったところ、His-GST-UGGT-PYPの発現が確認された。Hisタグを利用した方法では、目的タンパク質の単離はできなかったものの、GSTタグを利用したアフィニティ精製とゲルろ過精製を行ったところ、His-GST-UGGT-PYPを得ることができた。このHis-GST-UGGT-PYPとPYPプローブの一つであるPCAF-TAMRAを反応させたところ、タンパク質を示すバンドの位置から蛍光が観測された。また、スイッチ機能を持つ色素を導入したPYPタグプローブを反応させたところ、PCAF-TAMRAと同様にラベル化反応が進行し、タンパク質と化合物からなるSemisynthetic probeの構築ができることが示された。
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