2022 Fiscal Year Research-status Report
オペロンmRNA間の塩基対形成による新規連続代謝反応の実現と応用
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21K19063
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
宮腰 昌利 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (60755809)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 転写後調節 / small RNA / 3'UTR / オペロン / 代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原核生物のオペロンmRNAは複数のタンパク質をポリシストロニックにコードするだけでなく、その3´UTRから遺伝子発現制御能を持つsmall RNA (sRNA) を生成する。単独の転写産物として発現する通常のsRNAは、多くの場合標的mRNAの5´UTRと塩基対形成して、翻訳阻害もしくはmRNA分解を引き起こす。本研究は、mRNAの3´UTRからプロセシングを経て生成するsRNAが通常のsRNAと同様に、実際に細胞内で標的mRNAと塩基対形成するのか、もしくは3´UTRに制御配列を持つmRNA自体が標的mRNAと塩基対形成することが可能であるかを検証する。
共焦点レーザー走査型顕微鏡、活性化確率的光学再構築顕微鏡 (dSTORM)を用いてRNA局在を解析した。大腸菌の3´UTRプロセシングに必須のエンドリボヌクレアーゼであるRNase Eの野生株もしくは温度感受株を比較したところ、プロセシングの阻害によって制御性3´UTRと標的5´UTRの共局在性が減少する傾向にあることが示された。しかしながら、制御性3'UTRの標的5´UTRとの塩基対形成に必須の塩基を置換しても共局在性に変化が見られなかった。したがって、本研究の手法ではRNAの局在が定量的に解析できない可能性が示唆された。
mRNAの3´UTRからのプロセシングが制御性3´UTR由来sRNAによる標的遺伝子の制御に必須であるかを検証するため、mRNAの終止コドン直下流のRNase E切断サイトに塩基置換を導入した。3'UTRがmRNAから切り離されない状態では標的遺伝子の抑制が起きないことをウェスタンブロットで明らかにした。したがって、3´UTRに制御配列を持つmRNAではなく、切り離されたsRNAが標的mRNAと塩基対形成することで転写後調節が起きることが示された。この研究成果は論文の一部として2022年11月に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
mRNA 3´UTR由来sRNAが標的遺伝子の転写後調節を行うためにはプロセシングが必須であり、3'UTRがmRNAから切り離されない状態では標的遺伝子の抑制が起きないことを当初計画していた実験手法とは異なる戦略で明らかにすることができた。また、研究成果を論文の一部として2022年11月にeLifeに発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
複数のmRNA 3'UTR由来sRNAが機能解析されているが、本研究で3'UTRのプロセシングが転写後調節に必須である一例を示すことができた。今後は、mRNAの終止コドンと3'UTRの制御領域の距離が異なる他の遺伝子座についても解析を進める。
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| Causes of Carryover |
2023年度に予定していた論文投稿費を2022年度中に支出する必要があったため前倒し請求を行った。為替変動のため次年度使用額が生じた。差額分は次年度の物品費として使用する。
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