2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of sensor proteins which regulates mitochondrial dynamics in skeletal muscle
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21K19066
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
清水 誠 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (40409008)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | ミトコンドリアダイナミクス / 骨格筋 / ミトコンドリア / 老化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、昨年度に構築したスクリーニング方法（蛍光タンパク質をレポーターとした新たな実験系）により、shRNAライブラリーを用いた筋ミトコンドリアダイナミクス調節因子の発現を制御する新たな発現制御因子の探索実験を行った。ミトコンドリアダイナミクス調節因子の遺伝子発現調節領域（プロモーター領域及びエンハンサー領域）のレポーターを恒常的に発現するヒト骨格筋細胞株を樹立し、shRNAライブラリーを発現させるレンチウイルスを感染させ、薬剤により感染した細胞のみを抽出した。これらの細胞をFACSを用いて蛍光強度（プロモーター、エンハンサーの活性）が増加、もしくは低下する細胞を選別した。これらの細胞よりゲノムDNAの抽出・精製を行った。今回用いたshRNAライブラリーは標的遺伝子のshRNA配列に加え、該当遺伝子に対応するバーコード配列が含まれている。shRNA部分のDNA配列解析は困難であることが多いため、バーコード配列を標的としたDNA配列を標的とした次世代シーケンサー解析を行った。配列依存的にPCR増幅効率が異なることが予想されたため、PCRのサイクル数を最低限（15サイクル前後）、かつ次世代シーケンサーで解析可能な十分なDNA量が得られるPCRの実験条件を慎重に最適化した。本サンプルを用いて、バーコード配列を標的とした次世代シーケンサーを用いた配列解析を行っい、候補遺伝子の選定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度に、従来計画していたジフテリア毒素をレポーターとして用いる方法での評価が難しいと判断し、蛍光タンパク質を用いた方法に切り替えた。その後は順調に実験が進展しており、レポーター細胞の樹立、shRNAライブラリーを発現するレンチウイルスの感染実験、FACSを用いた異なる蛍光強度（遺伝子発現調節領域の活性）を有するレポーター細胞の分別、ゲノムDNAの回収、次世代シーケンサーを用いた候補遺伝子の選定まで実施することができた。今後、ミトコンドリアダイナミクスを制御する候補因子の同定、ミトコンドリアや骨格筋機能における機能解析、さらには機能性食品成分実験への展開する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
レポーター細胞を用いたshRNAライブラリーとFACSを用いた実験により、ミトコンドリアダイナミクス調節因子の発現を制御し得る遺伝子の候補を得ることができた。今後は、次世代シーケンサーの結果を精査し、候補遺伝子や、複数得られた場合はどのようなパスウェイに関与する因子群が存在するかを解析する。複数の候補遺伝子を選抜し、強制発現もしくはノックダウン実験等によりミトコンドリアダイナミクス調節因子の発現を制御する因子の同定を試みる。転写因子の場合は、標的DNA配列の探索解析等の実験を実施する。ミトコンドリアダイナミクス調節因子の発現が認められた因子に関しては、ミトコンドリア動態やエネルギー代謝等の変動などを解析する。培養細胞で活性が認められた因子に関して、in vivoエレクトロポレーション法等を用いて組織レベルでの解析を行う。具体的には、骨格筋ミトコンドリア機能、骨格筋量、トレッドミルを用いた運動機能解析などを検証する。さらに、転写因子が同定された場合、GAL4-UASシステムを用いた食品成分のスクリーニング実験を実施する予定である。
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Research Products
(7 results)
