細胞傷害顆粒を認識する膜結合型ハイブリッド分子の創製と高純度精製法の開発

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K19080
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 片岡 孝夫 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 教授 (20242307)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞傷害性T細胞 / 細胞傷害顆粒

Outline of Annual Research Achievements

細胞傷害性T細胞cytotoxic T lymphocyte（CTL）やナチュラルキラー細胞への遺伝子導入法を確立するために、前年度の実験結果を踏まえて、マウス細胞傷害性T細胞（CTL）由来CTLL-2細胞を選択し、ヌクレオフェクションによる遺伝子導入の条件検討を行った。その結果、EGFPもしくはLAMP1-EGFPを安定発現する少数のクローンが得られたが、Perforin-LAMP1(325-417)-EGFPやGranzyme_B-LAMP1(325-417)-EGFPを安定発現するクローンを得ることができなかった。そのため、遺伝子導入効率を上げるための試みとして、発現ベクターの改良を行った。制限酵素PvuIの切断部位を1箇所にするための変異導入に加えて、C末端にEGFPとエピトープタグFLAGを連結した発現ベクターを新たに構築し、融合遺伝子を挿入した。PvuIで直鎖状にした発現ベクターを用いてヌクレオフェクションを行った結果、EGFP-FLAGとLAMP1-EGFP-FLAGに加えて、Perforin-LAMP1(325-417)-EGFP-FLAGとGranzyme_B-LAMP1(325-417)-EGFP-FLAGを安定発現するクローンを樹立することに成功した。これらのすべての安定発現クローンでは、導入した融合遺伝子の発現が確認され、内在性パーフォリンの発現も検出することができた。以上の結果から、本研究では、可溶性タンパク質（Perforin、Granzyme B）と膜貫通タンパク質LAMP1の融合タンパク質を安定発現させたCTLクローンを樹立することに成功し、細胞傷害顆粒のアフィニティー精製を行うための実験材料を構築できた。