光スイッチを用いた次世代型不妊魚作出法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19133
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 林 誠 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 助教 (50714838)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉崎 悟朗 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (70281003)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 光スイッチ / ニジマス / CRISPR/Cas9 / 魚類

Outline of Annual Research Achievements

不妊化技術は養殖場から逃亡した個体による遺伝子汚染への対応策として、また、作出した優良系統のコピー防止策として、幅広い水産分野において注目されており、安定した簡便な不妊魚作出法の開発が期待されている。しかし、不妊化技術における大きな問題の一つは、不妊化した個体からは次世代を得ることができないことにある。そのため、ヘテロで系統を維持する必要があり、その交配で得られた次世代では1/4しか不妊にならないため、不妊魚の選抜を行う必要があるのが現状である。そこで、本研究では新たな不妊魚の大量生産技術として、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9法の有用性を検討することを目標に研究を行う。
これまで、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9は、培養細胞をはじめマウスなどにおいて利用されている。しかし、魚類、特にニジマスなど低水温環境で飼育される魚類においても光スイッチを利用したCRISPR/Cas9を用いた報告はないのが現状である。そこで、ニジマスをモデルとして、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9が利用可能かどうかを確かめることとした。そのために、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9の作用を容易に判別できるように、体色遺伝子の一つである、slc45a2遺伝子に着目した。この遺伝子はメラニン合成に関わるため、その機能を破壊すると黒色素が欠損し、アルビノの表現型を示す。そこで、slc45a2に対するgRNAをを発現させるためにニジマスで利用できると思われるU6プロモーターを検討し、そのコンストラクトと、光反応性のCRISPR/Cas9を全身で発現させるコンストラクトをデザインした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ニジマスで利用可能なU6プロモーターの検討をすすめたのち、slc45a2に対するgRNAをを発現させるためのコンストラクトと、光反応性のCRISPR/Cas9を全身で発現させるコンストラクトをデザインした。

Strategy for Future Research Activity

今年度の、ニジマス繁殖期の秋に、作成したvectorを用いて遺伝子導入魚の作成を進める予定である。これにより、光スイッチを利用したCRISPR/Cas9が、低水温環境で飼育されているニジマスにおいて利用可能かどうかを検討する予定である。

Causes of Carryover

U6プロモーターについての検討を進めたこともあり、当初の支出額には至らなかった。 次年度以降、遺伝子導入魚の作成を行い、解析を進めていくための飼育費用に充てていきたいと考えている。