Development of novel method for visualizing fish spermatogonia using transferrin receptor

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19138
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 市田 健介 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (70882637)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 生殖細胞移植 / 細胞表面抗原 / 生体染色 / トランスフェリン

Outline of Annual Research Achievements

申請者らはニジマスESTライブラリーにおけるin silico解析およびRT-PCR解析にて、ニジマストランスフェリン受容体1(tfr1)がA型精原細胞の膜表面で発現していることをこれまでに明らかにしている。そこで本分子の特性を用いて蛍光標識トランスフェリンおよび蛍光標識鉄をA型精原細胞に取り込ませることによる生体染色の樹立を最終目標として、昨年度は実際にtrf1のニジマス精巣および精巣細胞に対しての発現解析を行った。今年度は、発現解析でポリクローナル抗体を作成し、得られたtfr1抗体を用いてニジマス精巣細胞を酵素分散した生細胞に対して染色した結果、一部のA型精原細胞のみをヘテロに染色することが明らかとなった。また生体染色を行うためにトランフェリンに蛍光色素のAcidiFluor ORANGEを標識した蛍光トランスフェリンを用いて、ニジマス精原細胞の染色を試みたが、ニジマス生殖細胞特異的、あるいはtfr1抗体と一致する形のシグナルは得られなかった。しかしながら、tfr1抗体を用いて染色した一部のＡ型精原細胞をセルソーターを用いて分取し、ニジマス孵化稚魚に対する移植実験を行った結果、tfr1抗体陽性のＡ型精原細胞は抗体陰性のＡ型精原細胞と比較して高い値を示し、tfr1は生着能の高い細胞を標識できる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

上述の通り、本研究に取り組む過程で、tfr1陽性のA型精原細胞が陰性のA型精原細胞集団よりも生殖細胞移植に用いた際に高い生着能を有する可能性が示唆された。これは研究開始当初からは予想していなかった結果であり、今後の発展次第では精原幹細胞研究に大きな影響を与えうる大きな成果と言える。しかしながらトランスフェリンを利用した生体染色については当初計画した方法論に基づいた染色を達成できなかったため、他魚種への応用という点については取り組めていない引き続き生体染色については継続してゆく予定であるが、上記の理由から「やや遅れている」とした。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、蛍光トランスフェリンを用いた、ニジマス精原細胞の生体染色技術の開発を目指す。本研究ではhumanのトランスフェリンを用いたが、今後は組み換えタンパク質により作成したニジマストランスフェリンを用いて生体染色をはじめ今年度とは異なる蛍光トランスフェリンを使用予定である。またtfr1は生着能の高いＡ型精原細胞を標識できる可能性が示唆された。これまでの研究から生着能の高いＡ型精原細胞は生殖幹細胞である可能性が示唆されている。今後はtfr1陽性のＡ型精原細胞のトランスクリプトーム解析やノックダウン解析などを行うことで、精原幹細胞の研究へと展開可能と期待される。

Causes of Carryover

新たに明らかとなった知見から、実験計画の変更が生じたため。

Research Products

• [Journal Article] Cryopreservation of testicular cell in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) and its effects on apoptosis, germ-cell specific gene expression and germ cell transplantability (2023)
  • Author(s): Surintorn Boonanuntanasarn, Somkiat Sreebun, Kullanan Booncherd, Pongsawan Khaosa-art, Treerat Sooksawat , Kensuke Ichida, Nopadon Pirarat, Ryosuke Yazawa
  • Journal Title: Aquaculture Volume: 570 Pages: 739370
  • DOI: 10.1016/j.aquaculture.2023.739370
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Gametogenesis commencement in recipient gonads using germ cells retrieved from dead fish (2023)
  • Author(s): Fang Yang, Kensuke Ichida, Goro Yoshizaki
  • Journal Title: Aquaculture Volume: 552 Pages: 737952
  • DOI: 10.1016/j.aquaculture.2022.737952
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Production of germ cell-less rainbow trout by dead end gene knockout and their use as recipients for germ cell transplantation (2022)
  • Author(s): Ryo Fujihara, Naoto Katayama, Sakiko Sadaie, Misako Miwa, Gabriela Angelica Sanchez Matias, Kensuke Ichida, Wataru Fujii, Kunihiko Naito, Makoto Hayashi and Goro Yoshizaki
  • Journal Title: Marine Biotechnology Volume: 24 Pages: 417-429
  • DOI: 10.1007/s10126-022-10128-w
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アユ代理親魚技術の構築 (2023)
  • Author(s): 市田健介,鈴木弘貴,天野雄一,山川宏樹,松下芳之,丸山瑠太,阿久津崇,渡辺峻,塩澤佳奈子,鈴木究真,吉崎悟朗
  • Organizer: 第23回マリンバイオテクノロジー学会大会
• [Presentation] Production of offspring derived from cryopreserved spermatogonia by surrogate broodstock in ayu (Plecoglossus altivelis) (2023)
  • Author(s): Ichida Kensuke, Suzuki Koki, Amano Yuichi, Maruyama Ryuta, Matsushita Yoshiyuki, Akutsu Takashi, Shiozawa Kanako, Watanabe Shun, Suzuki Kyuma, Yoshizaki Goro
  • Organizer: 12th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 代理親魚技術による凍結細胞からのアユの生産 (2023)
  • Author(s): 鈴木弘貴,天野雄一,山川宏樹,松下芳之,丸山瑠太,阿久津崇,渡辺峻,塩澤佳奈子,鈴木究真,市田健介,吉崎悟朗
  • Organizer: 令和5年度 日本水産学会春季大会
• [Presentation] 抗生殖細胞抗体を利用した免疫学的不妊化技術の検討 (2023)
  • Author(s): 高瀬研志,市田健介,小祝敬一郎,吉崎悟朗,廣野育生,近藤秀裕
  • Organizer: 令和5年度 日本水産学会春季大会