質量分析法による原生生物の種組成解析に基づいた農業集落排水水質判定法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19168
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 石田 秀樹 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (70201316)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 種組成 / 質量分析 / PCR / 走査型電子顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

本研究は排水施設の原生生物を迅速に同定分類し，水処理環境を低コストで素早く判定するための基盤を構築することを目指している。今年度はコロナ感染症の影響により，当初予定していた排水施設でのサンプリングが出来なくなり，対象施設を一時的に変更して調査を行った。排水処理施設の生物反応槽から定期的な採水を行い，水質を測定した。続いて光学顕微鏡観察による出現種の同定と出現頻度，生息密度を計測した。また，光学顕微鏡で判別のつきにくい種については走査型電子顕微鏡での観察をおこなうことで明確な種同定を行った。その結果，この排水施設は出現種がほぼ一般的な種で構成されており，古典的なPC-indexで示される水環境評価に沿うものであることが明らかとなった。しかし，水質条件によっては出現種の種組成が変化するなどPC-indexから外れる場合があることから，PC-indexが提唱された時代から年月と共に出現種が変化し，それに伴って評価法を変えていく必要があると考えられた。また，新種であると考えらえる種が2種発見されたため，水質環境評価への有効性を検討中である。
一方，遺伝情報を用いた迅速な種組成判定に関しては，原生生物用のユニバーサルプライマーを設計してPCRを行い，リボソーム18Sを中心とした遺伝情報の収集を行った。しかし，安定した解析結果が得られなかったため，さらなる手法を模索中である。
また，質量分析についても安定した解析結果が得られなかった。これは，サンプルから個々の細胞を分離して分析にかける際，分離が十分でなかった，夾雑物が多かったなどの原因が考えられ，これについても改善策を検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナ感染症の影響により，当初予定の対象施設でのサンプリングが出来なくなったため，サンプリング対象を類似施設に変更し，サンプルの収集を行うことになった。
水質の測定や原生生物の種組成と出現頻度，生息密度に関するデータは比較的順調に進んでいる。光学顕微鏡で観察に加えて電子顕微鏡で観察おこなうことでより正確な種同定が出来るようになったことは評価できる。電子顕微鏡用試料の作成においては，水凍結乾燥法の手法を改良して用いることが出来たため，より迅速で簡便な判定にも有効と考えられる。
一方，PCR解析を行うために原生生物用のユニバーサルプライマーを設計したが，安定した解析結果が得られなかった。プライマーを再設計したり，より小分類群に対するプライマーを検討しているが，現時点では幅広く有効なプライマーを得られていない。
また，質量分析についても安定した解析結果が得られなかったため，手法の再検討を行っている。サンプルから精度高く個々の細胞を分離することが重要であることが判明し，この手技が十分でなかったことや，夾雑物が多く混入してしまったことなどが明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

今後は，当初予定の排水施設でサンプリングが出来るよう十分な感染症対策を提示するなどして当該施設管理者と交渉を進める。代替の類似対象施設において得られたデータが当初予定の施設での種組成判定に活用できるようデータベースの設計を見直し，複数の施設で種組成表と水質データが比較できるデータベースを構築する。それぞれの施設はすべて生物反応槽を利用した水処理を行っており，種組成に関するデータの蓄積は可能と考えている。
種同定のために走査型電子顕微鏡を用いての観察が有効であり，基礎データをさらに蓄積する予定である。
PCRによる出現種の遺伝情報取得については，引き続きプライマー設計を見直し，より効果的なプライマーとなるよう検討を行う。また，環境DNAの手法を活用することも検討する。
質量分析については，まず分離細胞単体での測定データ取得に専念するが，最終的には複数のサンプルを混合した状態でも判定をすることが必要となるため，適当なサンプリング方法を検討する。

Causes of Carryover

調査施設の変更により，予定していた研究のうち遺伝子解析と質量分析の進捗が遅くなった。
今年度は繰り越した予算を使って解析の総量を増やし，必要な情報量を確保したい。