2022 Fiscal Year Research-status Report

時期および組織特異的なプロテインノックダウンを可能とするデグロンシステムの開発

Research Project

Project/Area Number	21K19188
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	成瀬智恵京都大学, 医学研究科, 准教授 (30372486)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	浅野雅秀京都大学, 医学研究科, 教授 (50251450)
Project Period (FY)	2021-07-09 – 2024-03-31
Keywords	デグロン / マウス / プロテインノックダウン
Outline of Annual Research Achievements	生体でのプロテインノックダウンは，2022年に我々のグループを含めたマウス生体への実装例３例が初めて報告され，現在も世界的に改良が進められており，将来的に広く使用される技術になると考えられる。しかしながら，現在のところ，特異性や効率に改良の余地がある。そこで，これらの問題点を克服する方法の開発を進めており，現在，サリドマイドアナログを用いた簡便なプロテインノックダウン法の開発を目指している。サリドマイドアナログは，タンパク質分解に関わるE3ユビキチンリガーゼの構成要素の１つであるCRBNへ結合し，本来基質とならない「ネオリガンド」の分解を誘導し，様々な薬理作用を示す。これまで，サリドマイド誘導体に反応するデグロンタグをEGFPに融合させた遺伝子発現ベクター，および，Creにより反転すると初めて機能的になるタグを組み込んだ遺伝子発現ベクターを細胞に導入して，タグの反転効率およびタンパク質ノックダウンの効果を評価してきた。デグロンタグをC末に組み込むと効率の良いノックダウンが可能となることが明らかになった。また，Creを作用させることによって，タグの反転は高効率で行われ，ノックダウンが起こることが明らかになった。これまでヒト細胞，または，CRBNをヒト化したマウス細胞を用いて実験を行ってきたが，マウス細胞においても機能するタグを開発したため，今後は，野生型マウスで機能するサリドマイドアナログを用いたノックダウン系を用いて研究を進める予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason デグロンタグをC末に組み込むと効率の良いノックダウンが可能となることが明らかになった。また，Creを作用させることによって，タグの反転は高効率で行われ，ノックダウンが起こることが明らかになった。さらに，野生型マウスで機能する新規デグロンタグを開発した。
Strategy for Future Research Activity	今年度の研究で明らかにすることができた事象を元に，マウス細胞および生体での組織および時期特異的プロテインノックダウンを可能にするベクターを作製し，マウスへ実装する。
Causes of Carryover	マウスに最適なデグロンシステムの構築に時間がかかったため，動物の作製が次年度になった。よって，今年度使用した消耗品額が予定より減少した。来年度，動物の作製および維持のために使用する予定である。