2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of a method to determine RNA-protein complex by cryo-EM
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21K19201
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横山 武司 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (20719447)
長尾 翌手可 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 講師 (30588017)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| Keywords | RNA / クライオ電顕 / タンパク質複合体 / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ＲＮＡは多岐にわたる重要な役割を担う生体高分子化合物である。多くの場合、ＲＮＡはパートナー蛋白質と複合体を形成することにより複雑な生体反応を実現している。そのため、ＲＮＡの機能を理解するにはＲＮＡと蛋白質の複合体の構造を原子レベルで明らかにすることが鍵となる。本研究では、ＲＮＡ配列をリボソームＲＮＡに挿入して表面に露出させ、ここに結合するタンパク質を結合させることにより、「ＲＮＡ-蛋白質複合体」をリボソーム表面に形成させ、これを丸ごと構造解析する技術を開発することにより、RNA科学の研究領域を加速することをめざす。前年度までにループに任意のRNAを挿入したリボソームを調製し、またそれに結合するタンパク質分子の調製系を構築した。当該年度は、RNA挿入リボソームに目的タンパク質を結合させた状態で構造解析を行った。挿入RNAとタンパク質の密度は不明瞭であったため、この領域にマスクをかけてfocused classificationおよびfocused refinementにより、この領域の構造に応じて粒子を分類し、類似した構造を有する粒子を用いて3次元構造を再構成した。その結果、挿入RNAおよびこれに結合したタンパク質のマップを可視化することができた。剛体フィッティングを行い、RNAとたんぱく質の構造をフィッティングさせることにより、RNAとたんぱく質の複合体の構造モデルを構築することができた。一方で、明らかになった構造を比較すると、挿入RNA領域には相当なフレキシビリティーが存在することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
クライオ電顕単粒子解析により、RNA挿入リボソームの立体構造を高分解能で構造決定できる基盤技術を構築することができた。また、挿入RNAに結合したタンパク質を可視化し、RNAーたんぱく質複合体の構造モデルを実験により得られたマップから構築できた点は非常に大きな進捗と言える。一方で、focused classificationによって明らかになった構造では、挿入RNA領域の大きな構造変化が確認された。この構造変化により、可視化したい領域の密度は依然として不明瞭であり、改善が必要と言える。これらの状況を考え合わせ、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の研究により、挿入RNA領域が大きく動いていることがわかった。また、結合しているたんぱく質のマップの密度も不明瞭であった。挿入RNAの動きについては、複数の箇所に挿入して構造解析し、動きの少ない挿入箇所を見つけ出すことが重要と思われる。たんぱく質の密度の不明瞭さについては、RNA部分の動きとともに、タンパク質の占有度の低さが要因の一つと考えられる。占有率を上げるために、大多量のタンパク質を共存させることにより、平衡状態を複合体側に寄せ、複合体の割合を向上させることで、密度を改善することができると考えられる。これらの条件検討を行うことで、挿入したRNAと結合たんぱく質のマップの分解脳を向上させることが今後取り組むべき課題である。
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| Causes of Carryover |
挿入RNAのフレキシビリティーが高く、RNA-たんぱく質の高分解能構造を得ることができなかった。そのため、当初予定していた原子レベルのモデル構築の実験を実施することが困難であった。そこで、研究期間を延長して、複数の部位にRNAを挿入したリボソームを調製して構造解析を行い、フレキシビリティーの少ないRNA挿入配列を決定して、高分解能構造の取得を目指す。リボソームやタンパク質の調製、構造解析のための消耗品、および実験をする研究補佐員の人件費として使用する。
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