2022 Fiscal Year Research-status Report
イオンチャネル2次元密度と1分子活性：膜タンパク制御の新基軸展開に向けて
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21K19212
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | チャネル / 脂質2重膜 / 集散 / 電気生理 / 蛍光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では膜タンパク質の細胞膜上での離合集散と活性の関係を解明することを目標とし、それに向け、独自の人工細胞膜実験技術・CBB法を応用し、①膜タンパク質2次元密度制御の基盤実験技術の確立と、②イオンチャネルを使った実証実験を行う。
これまでに、蛍光標識した膜タンパク質・KcsAカリウムイオンチャネルを人工細胞膜に組込み、全反射蛍光(TIRF)観察にてKcsAに由来する多数の輝点を膜上に観察することができている。そこで、これら輝点が１個のチャネル分子に由来するものなのか、あるいは複数のチャネル分子が集合しているものなのか、輝点の蛍光消光ステップ数により判別を試みた。この実験に際し、励起光強度と撮影時間、そして撮影した映像から各輝点の消光ステップ数をカウントする方法について検討を行い、最適な実験手順を確立させた。興味深いことに、予備実験ではKcsAチャネルには膜上に単分子で存在している状態と、複数分子が集合している状態があることが示唆された。さらに、各状態の確率は溶液のpHや膜脂質組成によって変化する可能性を示す結果が得られた。溶液のpHはKcsAチャネルの活性化因子であり、また、酸性pHで活性化したKcsAは膜脂質組成によって活性修飾を受けることが明らかになっている。よって今回得られた結果は、集合状態と活性の関係を反映している可能性があり、今後より詳細な検討を行う必要がある。一方、当初の研究計画遂行に必要な、2次元密度のみに関与する不活性なKcsA変異体の作製については難航しており、適切な変異導入部位の発見にはまだ至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究開始直後に購入した高感度顕微鏡カメラの納入が遅れ（半導体不足の影響による）、蛍光観察実験の開始が予定よりも遅くなり、その影響が続いている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画の推進途中で派生した内容ではあるが、蛍光単分子観察によってKcsAチャネルの離合集散が溶液pHや膜脂質組成によって変化する可能性が示されたことは大変興味深い。今後この結果についての詳細な検討を続ける。また、当初のスケジュールより遅れている“膜面積操作”による物理的な離合集散制御法の確立と、その操作によるチャネル活性へ影響の検討も前進させたい。特に、その過程で必要となる2次元密度のみに関与する不活性なKcsA変異体の作製についてはこれまで難航してきた。今後は、１アミノ酸置換に限定せず、多重変異体も視野に入れ検討する。
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| Causes of Carryover |
購入した実験装置の納入が年度内に間に合わなかったため。翌年度の支出にこの実験装置が追加されるが、それ以外の支出計画に変更は無い。
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