2022 Fiscal Year Annual Research Report
単一細菌を用いた抗菌活性測定法の開発と抗菌ペプチドの抗菌メカニズム解明への応用
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21K19214
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
山崎 昌一 静岡大学, 電子工学研究所, 教授 (70200665)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| Keywords | 単一細菌解析 / 抗菌ペプチド / 抗菌活性 / 殺菌活性 / 生体膜の生物物理学 / 細胞膜の損傷 / ポア形成 / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物が産生するペプチドで細菌などの微生物の増殖を止める活性を持つ抗菌ペプチド(AMP)の抗菌活性や殺菌活性の測定には、最小発育阻止濃度（MIC）や最小致死濃度の測定やタイム・キル・アッセイなど細菌の集団を用いての長時間の測定が用いられてきた。昨年度から続いている本研究では、１個の細菌とAMPの相互作用と細菌の細胞死の相関を研究するために、単一細菌レベルでの抗菌活性および殺菌活性の短時間測定法 (単一細菌解析) を開発した。また、その方法を用いて、AMPによる細菌の細胞膜の損傷と細菌の細胞死の相関を調べた。
方法A（抗菌活性の測定法）では、種々の濃度のAMP存在下で細菌を3時間培養し、マイクロコロニーごとの細菌の数の分布をそれぞれのAMP濃度に対して求める。1個の細胞しか持たないマイクロコロニーの割合（Psingle）は、AMP濃度とともに増加し、ある濃度以上でPsingle = 1となった。この濃度は単一細菌レベルでの抗菌活性測定法におけるMICに相当する。方法B（殺菌活性の測定法）では、種々の濃度のＡＭＰと大腸菌を懸濁液中で時間tだけ相互作用させてから、十分に希釈して3時間培養し、その後マイクロコロニーごとの細菌の数の分布を相互作用の時間の関数として求める。AMP・マガイニン2の場合は、tが増加するにつれてPsingle(t)は増加し、やがて１に達した。Psingle(t)は時間tの相互作用後に死んだ細胞の割合を示す。
3種類のAMPについて、AMPとの相互作用により1個の大腸菌細胞の細胞膜にポア形成などの損傷が起こる確率Pdamage(t)を実験的に求め、それが上記の単一細菌解析・方法Bから求めたAMPによる大腸菌の細胞死の起こる確率Psingle(t)と高い相関があることを見出した。この結果は、AMPが誘起する細胞膜の損傷が細胞死の原因であることを直接示す。
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