2022 Fiscal Year Research-status Report
A novel gating model for a large pore channel in a lipid bilayer
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21K19215
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大嶋 篤典 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 教授 (80456847)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | large pore channel / クライオ電子顕微鏡 / 脂質膜再構成 / リポソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質チャネルを生体内に近い環境で構造解析することを目指して、ナノディスクやリポソームを用いた膜タンパク質の再構成技術を適用している。具体的にはLarge pore channelの一つとして知られるヒトpannexin-1(Panx1)のクライオ電子顕微鏡構造解析を行っている。これまでに野生型PANX1チャネルのオープン状態とクローズ状態の構造解析、および、N末端欠失変異体とC末端欠失変異体の構造解析をいずれもナノディスク再構成状態で成功している。野生型の閉塞構造とN末端欠失変異体の構造はチャネル通路の内側に通路を塞ぐ密度が現れて、脂質のアシル鎖の特徴を示す密度が確認され、脂質がチャネルの内側に入り込むことを示唆するものであった。Panx1チャネルの機能解析とMDシミュレーションを用いた脂質の流動性の解析を共同研究にて行い、これらを総合して、脂質がPANX1と相互作用しながらチャネル通路内へ移動する「脂質ゲーティングモデル」を提示した。また、ナノディスクよりもネイティブ環境に近い状態で構造解析を行うため、Panx1のリポソーム膜再構成にも取り組んでいる。精製したPanx1チャネルと可溶化した脂質の混合液から界面活性剤を除去することで、再現性良くリポソーム膜が作製できていることを負染色電子顕微鏡観察とクライオ電子顕微鏡観察で確認した。データ収集に適したクライオグリッドを作製するため、リポソーム作製条件の改善や、グリッド凍結条件検討を行い、クライオ電子顕微鏡による高分解能構造解析を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はLarge pore channelのヒトパネキシン1(Panx1)のリポソーム再構成を行った。Panx1を哺乳動物細胞にて発現し、精製した後に、Panx1の再構成した脂質リポソーム膜を効率よく作製することができた。脂質はSoy bean extractまたはPOPCを用いて試験管内にてフィルム状にし、界面活性剤を含まないバッファを添加して、チップソニケーションでリポソーム膜を作製した。作製したリポソームを一度界面活性剤のdodecylmaltosideで可溶化し、精製したPanx1を混合した後にバイオビーズを添加して界面活性剤を除去することで、リポソームへPanx1を再構成した。この試料をiodixanolの密度濃度勾配遠心法にかけ、凝集物はペレットに、空リポソームは上層にfloatationさせて分離し、中間層からPanx1再構成リポソームの画分のみを回収した。Panx1リポソームを負染色法で電子顕微鏡観察したところ明確に再構成粒子を確認することはできなかったが、クライオ電子顕微鏡観察ではPanx1粒子と思われるコントラストを確認した。また、Panx1リポソームを再度界面活性剤で可溶化し、蛍光ゲル濾過法で粒子のピークを確認できたことから、Panx1チャネルがオリゴマーを保った状態で再構成している可能性が高いと判断した。これらは他の膜タンパク質にも応用が可能な技術である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Panx1についてはクライオ電子顕微鏡の構造解析に持ち込みたい。そのためにリポソーム再構成の効率の向上と、単一膜リポソームに再構成されたチャネルを含むクライオグリッドを作製する必要があり、凍結条件の最適化を行う。特にクライオグリッド上でリポソームが重ならない試料を調製することが難しく、サイズが小さいリポソーム再構成膜の作製を目指す。そのためにリポソーム濃度と試料凍結条件を探索するほか、リポソーム作製条件の検討も行う。リポソーム再構成をする際にGFP融合型を用いて、作製したリポソームをアフィニティー精製する。この場合、細胞内表面が外側に向いたinside-outのチャネルのみ選択することができるため、その後の解析にも有利に働くと予想される。現在複数のギャップ結合ファミリータンパク質の発現にも成功しており、リポソーム再構成を適用していく。
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| Causes of Carryover |
技術補佐員の雇用の必要が生じたため。
また、クライオ電子顕微鏡観察に用いる寒剤の支払いにも充当する。
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