2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of light-driven neural devices
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21K19229
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
藤原 祐一郎 香川大学, 医学部, 教授 (20532980)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川鍋 陽 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| Keywords | イオンチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新しいタイプの光駆動性イオンチャネルおよび光駆動性膜機能蛋白質を創製することを目的とする。光異性化を起こすアゾベンゼンを利用して、電位依存性チャネルの電位センサーを動かし、光によるイオンチャネル活性の制御や電位センサーに付加した酵素などの機能分子の制御を行う。共通する電位センサーをターゲットにすることで、多くの電位依存性チャネルファミリーに適用できるため、これまでの光駆動性ツール(藻類由来チャネルロドプシン)にはない、ネイティブ神経チャネルの高いイオン選択性と軸索細胞膜局在・アクセサリー分子の会合を保つ光駆動性チャネルを次々に作成することが可能となる。これらの取り組みにより、分子構造や動作機構に立脚して戦略的に光駆動性チャネル・光駆動性膜蛋白を創製するプラットフォームを構築する。
本年度は、細胞外領域が殆どなく、ゲートに関係する膜貫通領域がカルボキシ端終末であり人工チャネルのテンプレートとして使いやすいことが期待されれ、BmGr9チャネルおよび、最小の電位センサーチャネルであるHvチャネルを対象に実験を進めた。AlphaFold2により予測した立体構造解情報を基に、チャネルがClosed構造からOpen構造に変化する際に変わる残基間距離を計算した。光異性化距離に相当する残基ペアに、アゾベンゼン誘導体を架橋するためのCys変異を導入した。
ポアヘリックス、近接するヘリックス間距離をアゾベンゼンの光異性化によりコントロールすることを試みた。網羅的に多くの変異体コンストラクトを作成し、変異体チャネルをXenopus卵母細胞に発現させ、アゾベンゼン誘導体をスルフヒドリル反応で付加し、光異性化波長を照射し、電気生理学的に測定した。本年度は、光で操作することができるBmGr9チャネルを3種類得ることが出来た。Hv電位センサーを光で操作するチャネルを得ることは出来なかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BmGr9チャネルの開閉を光照射によりコントロールすることに成功したため。次年度は、このチャネルを基盤として、発展的にチャネルの構造機能相関、細胞機能の光操作実験に進むことができるため。
本研究費で実験補助員(1名)を雇用し、レーザー光源およびその周辺装置を揃え、Cys導入変異体作成から電流解析まで一連の使いやすい解析システムを構築することに成功した。次年度以降に、解析システムが有効に働くことが期待できるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、扱いやすいイオンチャネルを用いて実験を進め、変異体作成から電流解析まで一連の解析システムを構築することに成功した。BmGr9チャネルの開閉を光照射によりコントロールすることに成功した。次年度は、BmGr9チャネルを基盤として、どのようにチャネルが光で開閉するのかを明らかにする構造機能相関研究、細胞機能を光でコントロールすることを試みる。また、Hvチャネルに対して構造－機能解析・分子計算まで含めて、これまで最も研究の進んでいる電位センサーを有する電位依存性チャネルを対象として研究を進める。数多くのCys導入変異体を作成し、スクリーニングを行う。適宜、立体構造予測、分子計算解析も導入し、プロジェクトの成功に繋げる。
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| Causes of Carryover |
発注試薬の納期の遅れ、および計算科学を取り入れて研究を遂行する必要が生じたため学内計算機器設備による分子構造計算を取り入れて研究を行ったため、物品費の使用に遅れが生じた。実験補助員の雇用が遅れたため、人件費の使用に遅れが生じた。社会情勢の変化により旅費が使用できなかった。
翌年度分として請求した助成金と合わせた、直接経費（4,032,497円）の使途は以下の通り。
物品費：2,100,000円、旅費：100,000円、人件費：1,800,000円、その他：32,497円。
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