2022 Fiscal Year Research-status Report
Native mass spectrometry of membrane proteins obtained from cultured cells
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21K19236
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / ネイティブ質量分析 / タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では、膜タンパク質を大量発現系で調製後、精製せずに膜に結合したままの状態で取り上げ、候補化合物との結合の解析を行うための高スループットな実験系の構築を目指す。そのためには、精製した膜タンパク質が特異的に結合するリガンドや情報伝達に関わる分子と形成する複合体を、ネイティブ質量分析で確かに観測できることを、予め確認しておく必要がある。昨年度、大腸菌および海洋性細菌由来の2種類の膜内プロテアーゼRsePについて、その阻害剤との複合体の状態でネイティブ質量分析で観測することに成功している。この際のデータを参考に、ヒトGPCRの一つβ2型アドレナリン受容体（β2AR）のネイティブ質量分析を試みた。その結果、薬剤との複合体の観測は難易度が高くS/Nの低いデータしか得られなかったが、受容体をはっきりとしたシグナルで観測することには成功した。これらの実験では、試料精製に用いる界面活性剤には膜タンパク質をより安定に保つことができるものを使用し、質量分析時に用いる界面活性剤はより剥がしやすい界面活性剤を用いることで、ネイティブ質量分析での観測が可能となった。このように、国内初のGPCRのネイティブ質量分析に成功した。
β2ARでは細胞内の情報伝達に対する薬剤（アゴニスト、アンタゴニスト）の薬効を評価するシステムを構築することを目指して、細胞質側の情報伝達に関わるGタンパク質との複合体として安定化させ、薬剤との複合体をネイティブ質量分析で観測することを検討した。その結果、Gタンパク質を模した低分子化タンパク質miniGsおよびnanobodyと複合体を形成させることで、アゴニストやアンタゴニストの薬効の違いをネイティブ質量分析で見極められる手法を構築することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GPCRはその安定性が低いため、人工的なミニGタンパク質との複合体とすることで、薬剤との複合体の観測を試みたがこれまでに成功していない。これは世界的に見ても誰も成功していない。この検討に予想以上の時間を要してしまい、生体膜に近い環境で膜タンパク質をネイティブ質量分析で観測する検討に着手できておらず、計画からやや遅れてしまったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで扱った膜タンパク質の中でもより安定なRsePについて、未精製の状態で取り上げてネイティブ質量分析を行うことを試みる。一方で、精製したRsePやβ2ARについて、リポソームやナノディスクなど脂質二重膜環境で再構成して、機能している状態を観測することを試みる。
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| Causes of Carryover |
GPCRのネイティブ質量分析は予想以上に難易度が高く、クリアすべき課題の解決に時間がかかったため、研究進捗が遅れたことによる。
今後、研究の加速を図り計画に見合った物品の購入を進めるとともに、学会や論文発表も積極的に行う等に使用したい。
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[Journal Article] Mechanistic insights into intramembrane proteolysis by E. coli site-2 protease homolog RseP2022
Author(s)
Y. Imaizumi, K. Takanuki, T. Miyake, M. Takemoto, K. Hirata, M. Hirose, R. Oi, T. Kobayashi, K. Miyoshi, R. Aruga, T. Yokoyama, S. Katagiri, H. Matsuura, K. Iwasaki, T. Kato, M. K. Kaneko, Y. Kato, M. Tajiri, S. Akashi, O. Nureki, Y. Hizukuri, Y. Akiyama, T. Nogi:
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Journal Title
Science Advances
Volume: 8
Pages: eabp9011
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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