長鎖シークエンシング技術を利用した環状RNAの全長一発同定手法の開発

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21K19238
• Research Institution: Hakodate Junior College
• Principal Investigator: 梅影 創 函館短期大学, 食物栄養学科, 講師(移行) (30419436)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Keywords: 環状RNA

Outline of Annual Research Achievements

環状RNAは、新たなバイオマーカーとなることが期待されており、バイオマーカーとなりうる環状RNAの検出が精力的に行われている。従来の環状RNAの検出方法は、イルミナショートリードを中心としたシークエンシングに環状化した部分の配列の検出が中心的であるが、この手法では環状RNAの全長を知ることができないという欠点があり、下流の解析によって全長を決定する必要があった。この問題を解決するために、オックスフォードナノポアテクノロジーズ社の長鎖シークエンシングを利用し、環状RNA配列を一気に決定するための手法開発をめざした。環状配列の決定に際し、環状RNAの逆転写産物がコンカテマートなることに注目し、シークエンシング後の配列のコンカテマーを決定することとした。一方、長鎖シークエンシングでは、読み取り精度が十分でないことから、ゲシュタルトパターンマッチングで冗長性のあるコンカテマー配列を検出することで環状RNA配列の決定が可能であることが予備的な実験で示すことができた。しかし、配列決定に長時間を要するため実用的でないということがわかった。そこで、レーベンシュタイン距離を探索するRapidFuzzを採用することによって検出速度を高めることができた。一方、配列に偏り（1塩基や2塩基繰り返し配列）のあるものも誤検出されることがわかったため、事前にこれらの配列に偏りのあるものを除くことで検出精度を向上させることに成功した。一方、ロングリードシークエンシング用のライブラリの作成方法については、十分に研究を進めることができなかった。環状RNAから効果的にコンカテマー配列cDNA配列を作成する手法の開発が今後の課題として残った。