2022 Fiscal Year Research-status Report
Developing new model microorganisms with diverse nutritional strategies by enhancing growth efficiency through genetic manipulation
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21K19240
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| Research Institution | Fukui University of Technology |
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Principal Investigator |
柏山 祐一郎 福井工業大学, 環境情報学部, 教授 (00611782)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 崇之 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 助教 (10595151)
中澤 昌美 大阪公立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (90343417)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 難培養性微生物 / ゲノム編集 / 従属栄養性プロティスト / ユーグレノイド / 盗葉緑体現象 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，実験細胞としての研究利用に資するが，効率的培養が容易ではない原生生物を開拓する道筋を切り開くことを目的としている。中でも，吸収栄養により有機物を摂取する能力は培養効率の観点から重要であり，これに関連する遺伝子をゲノム編集により導入することで，実験材料としての操作性を劇的に改善させるという方法論の確立を目指すものである。より具体的には，本来従属栄養生物の系統に属していながら緑藻から葉緑体を奪って利用する盗葉緑体現象を示すユーグレノゾア生物Rapaza（以下「ラパザ」）を中心に研究開発をおこない，その後，同じユーグレノゾア生物でも藻類食で食作用性の従属栄養生物ペラネマと純粋な光独立栄養性生物ユーグレナ藻についても手法を応用していくことを視野に入れている。本年度はラパザに関して，CRISPR-Cas9ゲノム編集による高効率の（1）ノックアウト実験系と（2）遺伝子ノックイン手法の確立を目指した。このうち（1）に関しては，Cas9で少し離れた2箇所を切断し，かつssODNを2本導入することで，高効率で切断箇所を「手つなぎ」させて任意の配列を欠損させる手法や，やはりssODNを用いたポイントミューテーションなどを，ほぼ自在に行うことができるようになった。また（2）に関しては，数十から100塩基程度のエピトープタグ配列を遺伝子の任意の箇所に高効率で導入できるようになり，抗生物質耐性遺伝子などのセレクションマーカーを用いることなく直接的なクローニングのみで容易に目的の変換体を得られるようになった。さらに，先進ゲノム支援により，ラパザとその葉緑体ドナーである緑藻テトラセルミスの全ゲノム解読が進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラパザのゲノム編集の実験手法の開発は，概ね順調に進み，様々ななノックアウト株やエピトープタグ導入株が得られた。また，外来の膜輸送体を細胞膜に発現させるためのアプローチについては，確実な膜輸送体として，ラパザの硝酸輸送体を同定し，その機能についてゲノム編集手法を駆使して検証し，論文化した。また，この膜タンパクの輸送に関して，ペプチドのＣ末端側に重要なシグナルが存在している可能性を突き止め，現在，Ｎ末端側の様々な箇所に糖輸送体を融合発現させる実験を進めている。また，同様なゲノム編集実験を近縁な藻類であるEuglena gracilisでも成功させた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラパザの硝酸輸送体に融合させたガルデリア由来の糖輸送体二より，ラパザに培地中からグルコースなどの糖を吸収利用させる事の実現を目指す。また，同様の融合タンパク質発現実験を，アミノ酸輸送体に関しても実施する。また，これらに蛍光レポーターやエピトープタグを融合発現させることで，細胞内における局在を確認する。さらに，2023年度前半に進捗が期待される全ゲノム情報の研究のデータから，同様の形質転換実験に有効な膜輸送体や細胞膜局在タンパク質を探索する。
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| Causes of Carryover |
ゲノム編集ノックイン実験による様々な細胞膜輸送体導入とこれによる「易培養化」確立ための実験を加速することで，この萌芽研究成果を今後の研究発展に波及させることが期待できる状況になったため，研究補助員を雇用して実験作業の効率化を図った。研究自体は順調に推移したが，研究員の体調不良による休暇が多かったことに加えて，ゲノム編集実験の効率化の影響で消耗品代を押さえられた効果などにより当初計画より余剰が生じた。よってこれを次年度の研究補助員の雇用継続のための資金として利用することで，さらなる研究の進展が期待できる。
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