2022 Fiscal Year Research-status Report
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21K19265
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
松井 貴輝 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (60403333)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 器官サイズ / 器官機能 / ゼブラフィッシュ / 左右差 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クッペル胞における機能補償は、1-1)細胞の浸透圧や水輸送に関与する分子が活性化され内腔が膨らむ。1-2)シリアが回転することで内腔に水流が発生する。2-1)水量が増えることで膨圧が細胞にかかる。2-2)水流によってシェアストレス発生する。3-1)膨圧で生じた力がメカノチャネルによって受容され、シグナルが活性化する。3-2)シェアストレスがメカノチャネルによって受容され、シグナルが活性化する。4)2つの反応の片方、または、両方により、水輸送、シリア回転速度が変化することで、適切な内腔サイズと水流速度に近づける。5)水流が弱くなりすぎたり、内腔が小さくなりすぎた場合は、再び、1が活性化され、サイズの違いを許容しつつ一定速度のノード流が発生するようになると考えている。これまでに、力感受カルシウムチャネルTRPC1および、シリアの回転速度に影響を与えるアセチル基転移酵素ATAT1の関与が推察されたので、昨年度、CRISPR/CAS9システムを用いて、クッペル胞で発現するTRPC1、および、ATAT1ノックアウト（KO）を行なった。その結果、TRPC1、および、ATAT1の両方の遺伝子に対してフレームシフトにより完全長のアミノ酸が形成されない変異体（F1世代ヘテロ変異体）を作製することに成功した。今年度、これらのヘテロ変異体同士を交配したところ、TRPC1の胚性KO個体では、心臓が直線状になるという左右差異常の表現型の一部が観察されたが、ATAT1の胚性KO個体では、心臓は体の左側に形成されていたため、左右差異常は認められないという結果であった。ATAT1に関しては母性因子として発現することが分かったため、ATAT1の胚性KO個体には母性因子由来のATAT1が存在していたことになるので、ATAT1の関与を解析するためには母性・胚性KO個体の作出が不可欠であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予定より時間がかかったが、TRPC1、ATAT1の2つの候補遺伝子に対する変異体株が作製できたので研究を加速させるべく、表現型解析を行った。しかし、予想に反し、候補遺伝子の欠損胚であっても軽微な左右差異常に留まった。そのためその原因を解明するための付加的な実験を実施しなければならない状況となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATAT1の母性・胚性KO個体を取得し、左右差異常があるかを観察する。得られた母性・胚性KO個体で、左右差異常があれば、クッペル胞の内腔の大きさ（水量）、細胞数、水流、シリアの回転、機能（心臓や内臓の配置）を調べることで、候補遺伝子が機能補償作用の堅牢さに影響するかについて解析する。また、TRPC1、ATAT1変異体が通常発生するときだけでなく、フェムト秒レーザーを用いた非熱的な細胞アブレーションによって細胞数を減少させたとき、一連のパラメーターがどのように変化するかを解析することで、候補遺伝子が機能補償作用の堅牢さに影響するかについても解析する。これらの通常発生胚、および、クッペル胞細胞減少胚から得られた定量データをもとに数理モデルを構築し、機能補償のしくみの理解を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究遂行に想定以上に時間を要し、研究計画の見直しが必要となったため。
研究に必要なビーズ式ホモジェナイザーMinilys(50万円以下)を購入する。また、残りの予算は、ゼブラフィッシュの飼育、ジェノタイピング、実験などを行うときに必要な費用、餌、タンク、消耗品、キット類などとして使用する予定である。
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