Epigenetic control of age-induced circadian oscillations and its adaptive effects on fitness

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K19277
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 松本 顕 順天堂大学, 医学部, 教授 (40229539)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 太一 九州大学, 基幹教育院, 助教 (20769765) ; 松本 綾子 順天堂大学, 大学院スポーツ健康科学研究科, 特任助教 (20833825)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2023-03-31
• Keywords: ショウジョウバエ / 時計遺伝子 / 老化 / エピジェネティクス / 発現制御

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、ショウジョウバエにおいて加齢が進行してから高発現を開始し、明瞭に概日振動を示し始めるlate-life cyclerの発現機序と適応的意義のエピジェネティックなゲノム修飾の観点からの解明である。初年度にあたる本年度は２方面からのアプローチを行った。
ひとつは、バイオインフォ解析によるlate-life cycler遺伝子群の転写調節領域に存在するコンセンサス配列の探索と関連因子の推定である。まず、若齢および老齢で周期発現のあった遺伝子群の発現プロファイルをクラスタ解析すると８クラスタに分類できた。これは概日振動の発現ピークとほぼ一致する。続いて、クラスタ毎に転写調節領域のコンセンサス配列を同定し、結合する転写因子を推定した。若齢群または老齢群に特異的な転写因子が７つ同定され、４つはある転写因子ファミリーに属する。この中には、自身も加齢によって高発現をはじめる転写因子も含まれ、加齢による高発現に直接的に関与する候補因子と推定される。この因子自身に対する発現誘導メカニズムは未解明であるが、late-life cycler遺伝子群の発現レベルが多段階カスケードで調節されている可能性が示唆された。
２つめのアプローチは、若齢群と高齢群で直接的にゲノムのエピジェネティックな修飾を比較する方策である。このために、ゲノムの修飾部位を網羅的に同定できるATAC-seqを採用した。ショウジョウバエの脳での解析で参照できる事例はなかったため、12匹と60匹での脳サンプルのATAC-seq結果を比較し、12匹で必要十分である結果が得られた。そこで、若齢群と老齢群で明期と暗期のそれぞれ1時間後の２つの位相、合計8サンプルについてATAC-seqを業務委託して解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

バイオインフォ解析から、late-life cycler遺伝子群の加齢に伴う高発現、または、若齢期特異的な発現抑制に関与すると思われる転写因子を７つ同定した。このうちの４つはある転写因子ファミリーに分類される。この中の１つは自身も加齢によって高発現をはじめることがわかっており、late-life cyclerの加齢による高発現に直接的に関与する候補因子と推定される。また、加齢に伴う遺伝子発現レベルの調節は多段階のカスケードである可能性が示唆された。この面では新知見が得られて研究は進展したとも判断されるが、候補因子の変異体はいずれも発生途中で胚致死となり、発生時期特異的な機能阻害実験や、該当遺伝子の過剰発現による機能変異の誘導を新たに考慮する必要がでてきた。迅速に機能解析を実行できなかったため、研究はやや遅れていると判断した。
若齢群と高齢群で直接的にゲノムのエピジェネティックな修飾を比較するために、ゲノムの修飾部位を網羅的に同定できるATAC-seqを採用した。ショウジョウバエの脳での実績はなかったため、解析に必要なサンプル量を調べる予備実験を行った。1ポイントあたり12匹の解剖された脳で解析可能とわかり、これはショウジョウバエの脳でのATAC-seqの最初の事例と思われる。この予備実験結果に従って、若齢群および老齢群のそれぞれに関して、明暗サイクルの明期開始から1時間後および暗期開始から1時間後の２位相でのサンプリングを行った。再現性の確認も含めて合計8サンプルを業務委託でATAC-seq中である。予想よりも予備実験に時間を要し、研究はやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

バイオインフォ解析から同定した転写因子ファミリーについては、発生途中での致死を回避して機能解析を行う方策の確立が必要である。このためには、発生時期特異的な機能阻害や、機能阻害を非常に限局的な組織でのみ行うこと、該当遺伝子の過剰発現による機能変異の誘導などが考えられる。1番目の発生時期特異的な機能阻害については、温度感受性Gal80とGal4-UASシステムを組み合わせた方法が第１選択となる。ただし、本研究の目的は、老化にともなう遺伝子発現変化の解明であり、対象として老齢個体を扱うことが必須となる。老齢個体が激しい温度変化に耐えられるか、また、温度ショックによる遺伝子発現への長期的な影響などを予備実験で精査する必要があると予想している。機能阻害の組織限局についての第１着手は、Gal4-UASシステムで時計遺伝子関連のGal4系統を用いる方策だが、late-life cyclerの発現が時計細胞特異的なものか判明しておらず、まずはその精査が前提となる。過剰発現については、現在、利用可能な系統の探索および譲渡依頼について検討中である。
ATAC-seqについては、現在は業務委託した解析結果を待っているところであり、今後の研究の推進方策はその結果次第となる。予備実験を行った上ではあるが、ショウジョウバエの脳をサンプルとしたATAC-seqは前例に乏しく、解析に失敗する可能性もあり、その場合はサンプリングから計画を練り直す必要が出てくる。一方、ATAC-seqから大域的に加齢に伴うゲノム修飾変化が得られた場合には、late-life cycler遺伝子群とそれ以外の領域に関しての共通点と相違点をバイオインフォ解析で抽出し、そのコンセンサス配列や原因となる転写関連因子を同定することで、エピジェネティック修飾によるlate-life cyclerの発現機序に迫る予定である。

Causes of Carryover

予算の多くをATAC-seqの業務委託費に使用する予定であったが、初年度内では業務委託した解析が終了しなかった。よって、支払いは次年度以降に繰り越された予算で行うことになった。また、ATAC-seqの解析結果を受けて実施する予定であった、クロマチン沈降による解析も、ATAC-seq解析の遅れによって初年度は未着手となった。このため、この費用も事前度以降に繰り越すこととなった。これらの予算支出は、次年度以降の予算執行計画とともに、次年度以降に行う予定である。