2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K19332
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
中津 亨 和歌山県立医科大学, 薬学部, 教授 (50293949)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
入江 克雅 和歌山県立医科大学, 薬学部, 准教授 (20415087)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| Keywords | 神経活動 / 生物発光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々の生命活動の維持には継続的な神経活動が行われることで達成される。神経情報伝達は活動電位という膜電位の変化が神経細胞から次の神経細胞への伝播でなされる。つまり、神経活動の正確な把握には神経細胞の膜電位の変化を正確にとらえることが必須である。この膜電位の可視化のために、膜電位感受性の小分子化合物や蛍光タンパク質の開発が進められている。
しかしながら、蛍光を発生させるためには励起光の照射が必要であり十分なシグナル対ノイズ比が得られない。さらに励起光と蛍光の波長が近い場合に分離が困難である。という問題がある。これに対し、化学反応による生物発光は、外部からの光照射は必要なく、発せられる光自体を観測できる。そこで本研究では、近年開発された発光エビの発光酵素の発光強度を改良した20kDa程度の発光タンパク質（NanoLuc）を用いた膜電位感受性発光酵素（VoltaLuc）を開発すことを目的とした。
そこで膜電位感受性イオンチャネルとしてはNavAbを用い、NanoLucとのキメラ蛋白質の発現を試みた。このイオンチャネルにはN末端側の四本の膜貫通ヘリックスは電位センサードメイン（VSD）とC末端側の二本の膜貫通ヘリックスによって形成された四量体のポアドメイン（PD）が存在する。そこでまずはVSDの細胞外ループに、NanoLucの157番目からのC末端の13残基のNativePeptide(NP157)を組み込み、156番目までのアミノ酸領域（NL156)を添加して光るコンストラクトの作成を試みた。しかしながら良好な発現が見られるものはなく、現在条件を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現段階では良好な発現を示すコンストラクトが得られていない。昨年から新しい研究環境に移動したため、そのセットアップに時間がかかり、十分な実験時間を費やすことができなかった。そのために、どのようなコンストラクトが適しているのかを試行錯誤するための実験が十分にできなかったためと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の第１段階のポイントとして、良好な発現をするコンストラクトを作成することである。そのためにはきちんとしたタンパク質のフォールディング、すなわち正しい立体構造が必要となる。昨年ごろから立体構造予測を行うAlphaFold2の精度が上がってきた。これに加え、これまでの構造情報をもとにしたホモロジーモデリングなども積極的に活用し、良好な発現を行うと考えられるコンストラクトをたくさん準備する。このような効率化を図ることで、より多くのコンストラクトを準備し、今年度の実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本実験の発光測定にはルミノメーターが必要である。既存の装置を利用する予定であるが、本実験をより効率よく実施するために装置の改良を行う予定で、昨年度中に発注を行っている。しかし、コロナの影響のため部品の調達が遅れているため、次年度の使用額が生じた。また、これと付随して高価である発光用基質の購入も控えていたため、現在のような状況となっている。すなわち、昨年度分についてはまだ使用はできていないが、すでに予定が計画できており、今年度は実験を実施するための遺伝子構築、タンパク質発現、精製、そして発光測定用の試薬の購入を予定している。
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