2021 Fiscal Year Research-status Report
多剤排出タンパク質複合体の阻害剤開発に向けた基質との網羅的な構造活性相関解析
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21K19337
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山下 栄樹 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (00294132)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | 構造生物 / 相互作用解析 / 薬剤排出タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
世界中では年間約70万人が薬剤耐性菌感染症で亡くなっており、薬剤耐性菌問題を克服することは世界的な重要課題の1つである。菌体における薬剤耐性化に関わっている主な原因の一つに、抗菌剤を菌体外に排出するRND型多剤排出タンパク質複合体の高発現により抗菌剤の増殖抑制を無効にすることが上げられる。RND型多剤排出タンパク質複合体の機能を阻害する分子の戦略的な開発に必要な情報を蓄積することが重要であると考えている。本研究では、巨大な膜タンパク質複合体であるRND型多剤排出タンパク質複合体と様々な基質との相互作用の定量化及び視覚化を目的に、1)各構成タンパク質及び複合体と基 質との相互作用の定量的なデータの蓄積、2)各構成タンパク質及び複合体の基質結合型の高分解能での立体構造情報の取得に取り組む。RND型多剤排出タンパク質複合体の試料として、研究代表者が機能する現場で形成する複合体の構造解析に成功した緑膿菌由来のMexAB-OprM複合体を用いている。
本年度は、MexAB-OprM複合体の構成タンパク質の一つである内膜タンパク質のトランスポーターMexBと基質との相互作用を再現性良く定量的に解析することを目的とした。トランスポーターMexBは膜タンパク質で分子量も約350,000と非常に大きいので、相互作用解析には高純度で安定な試料が大量に必要である。そのため、まずは、1-I) トランスポーターMexBの相互作用解析に適した試料調製方法の検討を行った。その後、1-II) トランスポーターMexBと基質との相互作用解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1)-I 相互作用解析に適した試料調製
トランスポーターMexBは膜タンパク質のため、試料調製に界面活性剤を使用している。しかし、MexBは様々な化合物を認識し排出する機能を担っており、界面活性剤の種類によっては試料調製に使っている界面活性剤が基質となる。その場合、抗生物質などとの相互作用解析では、正しく測定できない可能性があるので、まずは、界面活性剤の入っていない状態でMexBを安定にする方法として、MexAB-OprM複合体の電子顕微鏡解析に用いたアンフィポールを使って調製した。
1)-II 相互作用解析
抗菌剤とトランスポーターMexBとの相互作用の定量的な解析を行うために、等温滴定型カロリメトリーを用いて分子間で結合が起きた際に生じる熱量を測定した。先ずは、アンフィポール型MexBの濃度を10uMに調製し、MexAB-OprM複合体の電子顕微鏡解析の解析で用いた抗菌剤や既報のMexBとの構造解析で使われた抗菌剤についてタンパク質濃度の10倍濃度を用いて測定を行った。しかし、アンフィポール型MexBとそれぞれの抗菌剤との相互作用で生じる熱量が非常に小さく、バッファーのミスマッチによる影響が大きく測定結果の再現性が取れていない。
トランスポーターMexBの発現が不調になり原因究明に少し時間がかかり、また、アンフィポールを使った試料調製でも少し手間取ったために、相互作用解析が少し遅れたが、発現調製が不調になった際の対処方法や安定したアンフィポール型MexB試料を大量に調製する方法を確立できたので、今後の進捗には問題ないと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
MexAB-OprM複合体と基質との相互作用の定量的なデータを取得するために昨年度に引き続き、1) 各構成タンパク質と基質との相互作用解析、2) 各構成タンパク質と基質との結合型の構造解析を実施する予定である。
1) 各構成タンパク質と基質との相互作用解析
各構成タンパク質と基質との相互作用解析では、相互作用解析用の試料調製が困難だと予想されたトランスポーターMexBの調製方法が確立したので、その試料を用いて、まずは、等温滴定型熱量測定法により様々な基質との結合測定を進める。他の構成タンパク質（MexA, OprM）と基質との相互作用実験についても開始する。
2) 構成タンパク質と基質との結合型の構造解析
1)の相互作用解析から結合が強い基質について、基質結合型の結晶を作製し、X線結晶構造解析を進める。トランスポーターMexBについては、結晶化条件の異なる複数種類の結晶があるので、様々な結晶を利用して基質結合型の構造解析を行う。
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| Causes of Carryover |
トランスポーターMexBの発現が不調になりその原因究明のために、小容量で培養・精製の検討を行った。そのため、培養・精製で使用する試薬類の量が少なかったため使用額が少なかったが、次年度以降は、膜タンパク質の精製に用いる界面活性剤の相当量の使用が考えられる。また、膨大な量の相互作用データ及び構造解析データが予想されるので、それらの保存や解析を行うための計算機の補助パーツが必要になると考えている。
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Research Products
(1 results)
