2022 Fiscal Year Research-status Report
細胞内新生Sタンパクを標的とした新規COVID-19治療薬の開発
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21K19344
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
西川 喜代孝 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (40218128)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和久 剛 同志社大学, 生命医科学部, 准教授 (40613584)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Keywords | SARSコロナウイルス / 受容体結合部位 / ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）SタンパクのRBD(S1-RBD)を標的としたペプチド性阻害薬の同定（西川・和久）；バキュロウイルス発現系を用いてS1-RBDのC末端にHis-tagを導入したS1-RBD-(H6)、ならびにACE2との結合に重要な役割を果たしているアミノ酸（K417）に個別に変異を導入した一連の変異体を作成し、多価型ランダムペプチドライブラリー法による高親和性モチーフの取得を行った。なお、S1-RBDならびにK417A-S1-RBDとACE2との結合活性はELISA法を用いて検討済みであり、S1-RBDに比べK417A-S1-RBDでは結合活性が顕著に減弱していることを確認している。多価型ランダムペプチドライブラリー（ランダムアミノ酸を含むペプチドを4本有する４価型ペプチドライブラリー）をセルロースシート上に合成したものを作成した。１次ライブラリーでは7アミノ酸からなるライブラリー部全てについてランダムアミノ酸を導入している。本シートを、野生型S1-RBDとK417A-S1-RBDでブロットし、抗His-tag抗体を用いて各スポットへの結合量を評価した。スクリーンングにあたっては、K417A-S1-RBDよりも野生型S1-RBDにより強く結合することを指標にした。１次スクリーニングで決定した最適アミノ酸とその部位に関する情報をもとに、２次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った。これまでに、4次スクリーニングまで進行しており、候補となる5次スクリーニング用のライブラリーを３系統樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、RBDとACE2との結合に最も重要な役割を果たしているアミノ酸がK417であることを同定したことから、今回野生型S1-RBDとK417A-S1-RBDを用いて多価型ランダムペプチドライブラリー法による高親和性モチーフの取得を試みた。スクリーニングは4次まで進行しており、その都度重要なアミノ酸とそのポジションを同定することができており、順調に推進しているといえる。最終的には、7次スクリーニングまで到達し、７アミノ酸から構成される高親和性モチーフの取得を試みる。モチーフが取得出来次第細胞レベルへの検討も推進してゆく。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）K417を標的としたS1-RBD高親和性ペプチドのスクリーニングを推進する。スクリーニングは4次まで進行しており、最終的には、7次スクリーニングまで行い、７アミノ酸から構成される高親和性モチーフの取得を試みる。現在３系統まで拡充ができていることから、今後の進行具合によるが全体として20種程度の候補モチーフの取得を目標とする。モチーフが取得出来次第、４価型ペプチドを合成し、in vitroでの評価を行う。評価は、結合測度論的解析、並びにRBDとACE2との結合阻害を指標とした機能的解析、について行う。さらに、細胞レベルでRBDとACE2との結合活性を評価できる系（東京大学医科学研究所井上純一郎先生との共同研究）を用い、候補ペプチドについて阻害活性の検討を推進する。
２）抗ウイルスamphisomeを形成誘導する化合物の同定；４価型候補ペプチドから、S0３量体との結合活性を指標にスクリーニングを行う。細胞レベルでの抗Sタンパク活性の評価を行う。蛍光標識Sタンパクを発現させたHEK293細胞ならびにMDCK細胞を各４価型ペプチドで処理し、amphisome形成能ならびにSタンパク隔離能を共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価する。最終的に、細胞レベルでのSARS-CoV-2感染性に対する阻害効果を検討する。SARS-CoV-2の感染ならびに増殖が確認できるVeroE6細胞を用い、SARS-CoV-2の増殖に対する各４価型ペプチドの阻害効果を検討する。ウイルスの増殖はプラークアッセイにて定量的に評価する。
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| Causes of Carryover |
K417を標的としたS1-RBD高親和性ペプチドのスクリーニングについては、当初計画では22年度内に最終的に7次スクリーニングまで終了し、7アミノ酸の高親和性モチーフの同定を行う予定であった。現在順調に4次スクリーニングまで進んでいるが最終スクリーニングまでは至っておらず若干の遅れが出ている。このため、スクリーニングに使用するセルロースシート、合成に使用する各種アミノ酸、合成試薬、リコンビナントタンパク精製用の培養液、培養器具、活性評価用の生化学試薬等が当初の計画よりも少なくなったが、今後予定通り最終的に7次スクリーニングまで行う予定であることから、これら試薬の経費については来年度の計画に組み入れることとした。
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